一种水稻OsABCC9基因及其在转运镉中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种水稻osabcc9基因及其在转运镉中的应用。

背景技术：

镉(cadmium，cd)是一种对动植物有剧毒的金属元素之一。土壤中过量的镉可被植物根系吸收，从而抑制植物生长，降低作物产量。而且，被根吸收的镉可以从根转移到地上部分，进而积累到果实、谷物中，并通过饮食摄入进入人体内，长时间的摄入有毒的镉可引起肾功能不全、骨折、癌症等多种疾病。因此，阐明植物体内cd的转运过程和积累机制，有助于生产和开发低cd作物，从而减少或降低人类对cd的摄取量。

cd作为一种非必需元素，主要通过运输系统进入植物的根细胞，进入根细胞后的cd主要有三种转运途径：排出体外、隔离到液泡中和转移到木质部中。例如，拟南芥中的atpdr8(atabcg36)已被报道参与了cd或cd复合物的外排，其过表达后增加了转基因植株中cd的外排，降低了cd的含量，从而增加了植株对cd的耐受性。另外，cd或cd-复合物也可以通过液泡上的转运体被隔离到液泡中，以达到解cd毒的作用。例如，水稻中的oshma3蛋白参与了cd向液泡中的转运，从而降低了cd对水稻的毒害，而oshma3突变的植株未能将cd隔离到液泡中。此外，一些cd也可以转移到木质部，进而运输到地上部分以及种子或果实中。在水稻中，oshma2已被报道参与了cd和zn向木质部的转运。oshma2主要表达于根的维管束中，其突变后降低了cd和zn从根到茎的转移。总的来说，cd转运体对植物体内cd的解毒和积累都发挥着重要作用。

atp结合盒式(atp-bindingcassette，abc)转运蛋白是在原核生物和真核生物中发现的一个蛋白超家族。根据转运蛋白的结构域和系统发育关系，将植物abc转运蛋白分为8个亚科(a-g,i)。abc蛋白转运底物种类繁多，包括脂类、金属和植物激素等。目前已有多种abc转运蛋白被报道能够转运cd或cd-复合物。第一个被称为cd转运体的abc转运体是裂变酵母中的hmt1，它可以将pc-cd复合物转运到液泡中已达到cd解毒的作用。随后，在不同物种中发现了参与cd转运的abc转运蛋白。在拟南芥中，除了atabcg36之外，三种c型abc转运蛋白atabcc1、atabcc2和atabcc3也通过将cd或cd复合物隔离在液泡中进而增强cd的耐受性。

在水稻中，有133个基因被注释为abc转运体基因，其中2个基因被报道参与了cd的耐受性。osabcg43在水稻根系中受cd诱导表达，在酵母中表达可以增加酵母的cd耐受性，但其在水稻中的确切功能目前尚不清楚。osabcg36在水稻的根中的表达，也受cd的诱导，其定位于细胞膜上，osabcg36突变后增加植株根中cd的积累，因此osabcg36被认为是通过从水稻的根细胞排出cd或cd复合物来增加对的cd的耐受性。目前，现有报道中还未发现新的水稻abc转运蛋白家族基因对镉耐受的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水稻osabcc9基因及其在转运镉中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种水稻osabcc9基因，所述水稻osabcc9基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的水稻osabcc9基因在转运镉中的应用。

本发明提供了一种水稻osabcc9基因及其在转运镉中的应用。本发明提供的水稻osabcc9基因具有转运镉的作用，所述水稻osabcc9基因编码的蛋白在植物的解镉毒过程中发挥重要的作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的水稻osabcc9基因主要在根中表达，并且受cd的高度诱导。

(2)利用水稻原生质体细胞分析osabcc9亚细胞定位情况，表明其定位于液泡膜上。

(3)使用crispr-cas9技术进行突变体植株的构建，筛选了两个不同突变位点的纯合突变体植株进行植株实验。突变体植株使用cd处理后发现，突变体植株根和茎的干重、cd含量显著性少于野生型，对cd表现出敏感现象。结果表明，在水稻中osabcc9参与了cd的耐受性调控。并且，osabcc9突变后，增加籽粒中的cd含量，说明osabcc9基因影响水稻种子中的cd积累。因此，水稻osabcc9是一个新的参与镉耐受性和镉积累的基因。

附图说明

图1为水稻和拟南芥中abcc转运蛋白的进化树分析图；

图2为osabcc9基因结构图和纯合突变体植株类型；

图3为osabcc9在根和茎中的表达水平；

图4为不同处理时间、不同cd浓度处理对osabcc9表达水平的影响；

图5为osabcc9在水稻原生质体中亚细胞定位情况；

图6为osabcc9突变体植株镉耐受性分析及cd含量测定；

图7为osabcc9突变体植株种子中镉含量分析。

具体实施方式

本发明提供了一种水稻osabcc9基因，所述水稻osabcc9基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，具体如下：

atgccgatgccggccacctcgctcccgtggtggctgtccaccaccgcgtgctccccgcctccgccgtcttcctcctccttctccctctccgaccgcctcgccttcctcttcctctccccatgcccgcagcgcgtggtcctcggcggcgccgtcgacctcgccttcctcctcgcggtggtgttcgtcgccgtccgcgctcgcttgtcgcggtcccggcgtgagggtatcgcgaacggcaacggggaccacgcggaggaggagcccctgctcgcgaagccgtctgtggtggctgcggtgcccccgccgcccccgcgcggggggttgcggcacgcgctcgcgctcgcggcgtccgtgtgtttcgcggccgcgtcgctcgtgctgctcgtgctcgcggtcgtgctgctcccgaggaccgcatggctcgccgcggagtgcgcgttcctcgtggcgcagttcgtggcgcacctcgccgctgtgggggtcgtcgtggcggagaaggcggccgcggcgcgttctcacccggcgcacctccgtctcttctgggctgggactgcggctctcgcggcgctcttctccggctccgcggctgcgcgctacgcggctcgcgagcccatcctccccgacgatgccgtcgcgttcgctgggctggtgatgtcgctccctcttctctacttctccgtcaccggctccaccggcctcggtggtgcggcgattcccgacggggaagaccgaagctgtgttccgggtcacgccgcggcggcggcgtcgtactcgacggcgtcgtggttgtcgctcgcgacgttcagctggatcaacccgctcatctccaagggctccagggcggctctcgccgcggacgatgtcccgcccgtggcgccagatgataccgccgaggcgacttacgcgctgttcgtgtcaaactgggccgcgccgccggcgccggggactaaggccgggcatcccgtggtcaccgcacttctccggtcgttctggccgcagttcttgctcaccgccatgctcggcctggcgcacctctcggtcatgtatatcggcccttccctcgtcgacaggttcgtgaatttcgtccgccgcggcggggagttgacggaagggcttcagctggtcgtcgtcctcctcgccggcaaggcggcggaggcgctggcctcgcaccactacgagttccaggggcagaagctcgggatgcgcatccacgccgcgctgctcgccgcggtgtaccgcaagtcgctgcggctgtccacgggcgcgcggcgcgcgcacggcgccggcgcgatcgtgaactacatggaggtggacgccgaggaggtggccaacgtcacgcacgagctccacaacctgtggctgatgccgctggagatcgccgtggctctcaccctgctgtacacccacctcggccccgccgtgctcaccgcggtcgccgcgatcgccgtggtgaccgtggtcgtggcgctcgccaaccgccgcaacctggagtaccagttcaagttcctcggcaagcgcgacgagcgcatgaaggccatcaccgagctgctcaactacatgcgcgtgatcaagctgcaggggtgggaggagacgttcggcggcaagatccacgagctcagggaggctgagctcgggtggcttgccaagtccatgtacttcatgtgcgccaacaccgtcgtgctctggagcggcccgctcgccatgaccgtgctcgtgttcggcacctgtgtgctgaccggcgtcacgctcgacgccggcaaggtgttcacggccaccgccttcttccacatgctggatggaccaatgcagagcttccccgaggcgattgcctccgtgacgcaggcgaccgtgtcactggggaggcttgacaggtatctgctcgacgtggagcttgatgataccacggtggagcgtgttgatgacgctgggattaaccctgatggtgtggtcgtggaagtgcgcgatggcgtgtttgcatgggacgtgaggggcaagaaggagaatgaagagggcgacgacaacgaggatgatgaagaaggtgaggaggaggaggaggagaaagatgtcgaggagacgcctgttctggagacagtgctgaaggggattaacattgaggtaaggaggggtgagcttgcagcggtggtcgggacggttggctccggcaaatcgtcgctgctgtcatgtatcatgggggagatggacaaggtctccgggaaggttaggatatgcgggagcactgcatatgttgcacagactgcttggattcaaaatggcacaattcaagagaacatcttatttgggcagccaatggatgctgaaagatataaagaagttctgcggtctcgagggatcaatctcagtggtggacaaaaacaacgtattcagcttgccagggcagtttattgcagcctggaaaaggatttggaaatgatggaatttggtgaccagacagagattggagagcaaaattgtgatatatatctccttgacgatgtcttcagtgcagttgatgcacatactggctcaagcatttttaaggaatgtctgagaggcatgctcaaaggaaagaccatcttacttgtaactcaccaagtggatttcttgcataatgtggataacatatttgtcatgagagatggcatgattgtgcagtcagggaaatatgatgagttactagatgctggctcagatttcttagctcttgttgctgctcatgatagttcaatggaactggtggatcaaagtcgacaagttgtcaaaactgaatattctcagcctaaggcggtagccagaattccttctcttcgctctagatccattggaaagggtgagaaggtacttgttgcacctgatatagaagcagctacttctaaaattatacgagaagaggaaagagaaagtggtcaagtaagttggcgtgtgtacaagttatatatgacagaggcttggggttggtggggggttgtcggcatgcttgcttttgcaattgtatggcaagttactgaaatggctagtgactattggctgtcatatgaaacatcaggcagcattccatttaatccatctctatttattggagtgtatgttgctatagctgctgtttcaattatccttcaagtaatcaagagtcttcttgagacaatattgggacttcagactgctcagatctttttcaagaagatgtttgacagtattttgcatgccccgatgtcattttttgataccacaccttcagggaggattctcagtcgggcatcatcggaccaaacaaccattgatattgtgctgtccttttttgttggtctgacaatttcaatgtacatttcagtattaagtaccataattgttacttgtcaggttgcctggccatcggttatagctgtaattccacttgtactattgaacatttggtacaggaatcgctatcttgcaacttctcgggagctaactagacttgaaggagtaacaaaggcaccagtaattgatcacttttcagagactgttctaggtgctacaaccatcagatgcttcaagaaggacaaagaatttttccaagaaaatttggacagaatcaattcaagtttgcgcatgtacttccacaattatgcagcaaatgaatggcttgggttccgtctggagttgattgggacactcgtattggcaataactgctttccttatgattagtctgcctagcaattttatcaagaaagaatttgttggcatgtctctttcatatggcctctccctcaattctctagtgtattttgcaatatccattagctgtatgttggaaaatgatatggttgctgtggagagggttaatcagttcagtacccttccttctgaggcagtgtggaagatagaagaccatcttccttctccaaattggcccactcatggtgatattgacatcgatgatttaaaggttaggtaccgaccgaatacacctctaattttgaaaggcataactgtaagcattagtggtggtgaaaagataggagttgttggaagaacaggcagtggaaaatcaactttgatccaagcattgttcagacttgtagagcctgtgcaggggacaatgatcattgatggaatagacatatgcacattgggtctgcatgatctgaggtcccgctttggcattattccccaagaaccagttctctttgaaggaacaattcgaagcaacattgatccaattgggcagtattcagatgctgagatatggcgggctctggagggctgccaactgaaagatgtagttgcttcaaaacctcaaaaacttgatgctctagtggctgatagtggggagaactggagtgtaggccaaaggcagcttctttgtcttggccgcgtcatattgaagcggactcgaatattatttatggatgaggcaactgcttcagttgattctcaaactgatgccacgatacagaagatcacacgacaagaattttcttcatgtacaataattagcattgcacacagaataccaacagtcatggattgtgatagagttctggtgctggatgcaggtctggtaaaagaatttgattcaccctcaagattgattgagcagccatccctgtttggtgcaatggttgaggaatacgccaatcgctcatccaacctgtaa

在本发明中，亚细胞定位分析显示osabcc9定位于液泡膜上，所述osabcc9基因全长为4638bp，具有11个外显子和10个内含子，其基因结构图如图2中的a所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的水稻osabcc9基因在转运镉中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.植物材料和生长条件

本实施例使用的材料有野生型日本晴水稻和两个osabcc9突变体植株。

将水稻种子浸泡于自来水中，放于28℃培养箱中黑暗发芽2d后，将种子摆于滤网上，放于含有0.5mmcacl2去离子水的4l塑料容器中，28℃继续培养2d。待根长长至2-3cm后用于后续相关实验。

2.osabcc9基因全序列的获得以及进化树的构建

为了获到osabcc9的cds序列，按照产品的说明书使用trizol试剂盒(lifetechnologies)从水稻根中提取总rna。取1μg总rna使用hiscriptiiqrtsupermixkit(vazyme)合成试剂盒合成cdna的第一条。获得的cdna作为模板，用于下列不同实验中获得osabcc9的全序列。

水稻和拟南芥中的abcc家族蛋白的系统进化树主要通过tair(https://www.arabidopsis.org/)和ncbi(www.ncbi.nlm.nih.gov)下载该家族的全长氨基酸序列。然后，使用mega6软件通过邻近法进行系统进化树的构建(图1)。

3.osabcc9突变体植株构建

osabcc9基因(seqidno.1)全长为4638bp，具有11个外显子和10个内含子，其基因结构图如图2中的a所示。

使用crispr-cas9基因组编辑系统来构建osabcc9基因的突变体植株。首先，在osabcc9的外显子区选择两个目标靶点，序列分别为ggcgccagatgataccgccg(seqidno.2)和gccttcttccacatgctgga(seqidno.3)，构建了具有两个osabcc9特异性靶点的pcrispr-osabcc9质粒。然后，利用土壤农杆菌介导的遗传转化方法，来侵染野生型日本晴水稻构建突变体植株。最后，设计相应引物，利用pcr对目标靶点位置的序列进行扩增，并经过测序验证后，选择了两个独立的纯合突变体植株(osabcc9-1和osabcc9-2)进行下列实验，结果如图2中的b所示。

3.rna的提取和基因表达水平分析

为了分析osabcc9表达模式，取15d大的野生型水稻植株使用10μmcd处理6h，对根和茎分别进行取样，取样后立刻放入液氮中，并以未经cd处理的样品为对照组。使用trizol试剂试剂盒(lifetechnologies)提取样品的总rna。然后，使用hiscriptiiqrtsupermixkit(vazyme)，进行cdna第一条链的合成。并使用chanq^tmsybrcolorqpcrmastermix(vazyme)试剂盒和steponeplusreal-timepcr系统(analytikjena)进行qrt-pcr实验分析。osabcc9基因表达所用的引物序列为(seqidno.4)5’-ggaaagagaaagtggtcaagtaag-3’和(seqidno.5)5’-ttaaatggaatgctgcctgatg-3’；内参选择的是组蛋白h3，其引物序列为(seqidno.6)5’-ggtcaacttgttgattcccctct-3’和(seqidno.7)5’-aaccgcaaaatccaaagaacg-3’，结果如图3所示。

由图3可知，本发明的osabcc9基因主要在水稻的根中表达，并且受cd的诱导表达。

为了分析osabcc9表达水平对cd的详细响应情况，首先，取5d大野生型水稻幼苗分别使用10μmcd分别处理0，1，3，6，12，24h后取主根样品并提取rna；其次，使用0，5，10，15，20μmcd处理6h后取主根样品提取rna；并使用上述方法进行qrt-pcr分析，每组实验4个重复，结果如图4所示。

由图4中的a可知，前6h内，随着时间的增加，表达水平依次增加，6h时达到最高，随后逐渐递减。由图4中的b可知，osabcc9基因的表达受cd的诱导，且随着cd浓度的增加，表达水平依次升高。

4.osabcc9的亚细胞定位分析

为了分析osabcc9的亚细胞定位情况，构建osabcc9-gfp融合表达载体。使用osabcc9特异的引物(seqidno.85’-aagcttcatgccgatgccggccacctcgctc-3’和seqidno.95’-ggatccccaggttggatgagcgattggc-3’)使用pcr扩增出osabcc9的全长序列(seqidno.1)(去终止子)。然后，将扩增的片段克隆到pyl322-gfp载体上gfp编码区的前面，产生gfp-osabcc9重组质粒。

实施例2

1.利用peg介导转化的方法，将实施例1得到的质粒gfp-osabcc9或gfp空载体分别与液泡膜标记质粒attpk1共同转化于水稻原生质体细胞中，在室温下孵育后，利用激光共聚焦扫描显微镜(tcssp8；leica)进行拍照，结果如图5所示。

由图5中的a-d所示，gfp空载体(绿色荧光)定位于细胞质和细胞核等位置，而液泡膜标记attpk1(红色荧光)只定位于液泡膜上。然而，由图5中的e-h所示，gfp-osabcc9与attpk1共定位结果发现，绿色荧光和红色荧光可以融合，说明osabcc9定位于液泡膜上。

2.osabcc9突变体植株的表型分析及cd含量分析

为了研究osabcc9突变体植株对cd的耐受性，取15d天大的野生型和2个osabcc9突变体植株幼苗分别转移至含有0和10μmcd的1/2kimurab营养液中培养12d，每3天更换一次营养液。处理结束后，进行拍照，并对根和茎部使用5mmcacl2和去离子水分别洗涤3次后进行取样。然后，将样品放在70℃的烘箱中干燥5天后，称量干重。加入适量的浓硝酸，并使用石墨消解仪进行消解后，使用icp-ms(plasmaquantms；analytikjenaag)测定镉的浓度，结果如图6所示。

由图6中的a可以看出，未经cd处理的突变体植株与野生型长势一致，而经过cd处理后，突变体植株的根长短于野生型(图6中的b)。对根和茎分干重进行称量发现，经cd处理后，突变体植株的根和茎的干重显著轻于野生型(图6中的c,d)。对样品中的cd含量进行测定发现，经cd处理之后，突变体植株根和茎中的镉含量显著性高于野生型(图6中的e,f)。说明osabcc9突变之后，导致水稻根和茎中的cd的增加，进而对水稻植株产生了毒害作用。

3.osabcc9突变体植株种子中cd含量分析

为测定籽粒中cd的浓度，将40日大的野生型和2个osabcc9突变体植株转移到2mg/kgcd的土壤中，培养至收取种子。取干燥后的去壳种子，加入适量的硝酸后，使用石墨消解仪消解后，使用icp-ms测定cd元素含量，结果汇总见图7。

由图7所示，突变体植株种子中的cd含量显著高于野生型，说明osabcc9突变之后，增加了cd在种子中的积累。

由以上实施例可以得出，osabcc9是一个定位于液泡膜上的转运蛋白，在水稻中参与了对镉的转运，增加了水稻对镉的耐受性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>广西大学

<120>一种水稻osabcc9基因及其在转运镉中的应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4638

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgccgatgccggccacctcgctcccgtggtggctgtccaccaccgcgtgctccccgcct60

ccgccgtcttcctcctccttctccctctccgaccgcctcgccttcctcttcctctcccca120

tgcccgcagcgcgtggtcctcggcggcgccgtcgacctcgccttcctcctcgcggtggtg180

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ggggaccacgcggaggaggagcccctgctcgcgaagccgtctgtggtggctgcggtgccc300

ccgccgcccccgcgcggggggttgcggcacgcgctcgcgctcgcggcgtccgtgtgtttc360

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ctcgccgcggagtgcgcgttcctcgtggcgcagttcgtggcgcacctcgccgctgtgggg480

gtcgtcgtggcggagaaggcggccgcggcgcgttctcacccggcgcacctccgtctcttc540

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ggggaagaccgaagctgtgttccgggtcacgccgcggcggcggcgtcgtactcgacggcg780

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tacgcgctgttcgtgtcaaactgggccgcgccgccggcgccggggactaaggccgggcat960

cccgtggtcaccgcacttctccggtcgttctggccgcagttcttgctcaccgccatgctc1020

ggcctggcgcacctctcggtcatgtatatcggcccttccctcgtcgacaggttcgtgaat1080

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gaggtggccaacgtcacgcacgagctccacaacctgtggctgatgccgctggagatcgcc1380

gtggctctcaccctgctgtacacccacctcggccccgccgtgctcaccgcggtcgccgcg1440

atcgccgtggtgaccgtggtcgtggcgctcgccaaccgccgcaacctggagtaccagttc1500

aagttcctcggcaagcgcgacgagcgcatgaaggccatcaccgagctgctcaactacatg1560

cgcgtgatcaagctgcaggggtgggaggagacgttcggcggcaagatccacgagctcagg1620

gaggctgagctcgggtggcttgccaagtccatgtacttcatgtgcgccaacaccgtcgtg1680

ctctggagcggcccgctcgccatgaccgtgctcgtgttcggcacctgtgtgctgaccggc1740

gtcacgctcgacgccggcaaggtgttcacggccaccgccttcttccacatgctggatgga1800

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aggcttgacaggtatctgctcgacgtggagcttgatgataccacggtggagcgtgttgat1920

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gacgtgaggggcaagaaggagaatgaagagggcgacgacaacgaggatgatgaagaaggt2040

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gggattaacattgaggtaaggaggggtgagcttgcagcggtggtcgggacggttggctcc2160

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actgaatattctcagcctaaggcggtagccagaattccttctcttcgctctagatccatt2820

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actgaaatggctagtgactattggctgtcatatgaaacatcaggcagcattccatttaat3060

ccatctctatttattggagtgtatgttgctatagctgctgtttcaattatccttcaagta3120

atcaagagtcttcttgagacaatattgggacttcagactgctcagatctttttcaagaag3180

atgtttgacagtattttgcatgccccgatgtcattttttgataccacaccttcagggagg3240

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attgatcacttttcagagactgttctaggtgctacaaccatcagatgcttcaagaaggac3540

aaagaatttttccaagaaaatttggacagaatcaattcaagtttgcgcatgtacttccac3600

aattatgcagcaaatgaatggcttgggttccgtctggagttgattgggacactcgtattg3660

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agctgtatgttggaaaatgatatggttgctgtggagagggttaatcagttcagtaccctt3840

ccttctgaggcagtgtggaagatagaagaccatcttccttctccaaattggcccactcat3900

ggtgatattgacatcgatgatttaaaggttaggtaccgaccgaatacacctctaattttg3960

aaaggcataactgtaagcattagtggtggtgaaaagataggagttgttggaagaacaggc4020

agtggaaaatcaactttgatccaagcattgttcagacttgtagagcctgtgcaggggaca4080

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ggcattattccccaagaaccagttctctttgaaggaacaattcgaagcaacattgatcca4200

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gtagttgcttcaaaacctcaaaaacttgatgctctagtggctgatagtggggagaactgg4320

agtgtaggccaaaggcagcttctttgtcttggccgcgtcatattgaagcggactcgaata4380

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