一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用与流程

[0001]
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用。


背景技术：

[0002]
新型冠状病毒(2019-ncov，sars-cov-2)是一种β属的冠状病毒，感染该病毒后可导致患者出现发热、干咳、乏力等症状；部分患者会产生严重的肺炎，进而发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等，甚至死亡。sars-cov-2病毒通过其表面的囊膜蛋白吸附和进入宿主细胞，从而感染人的呼吸道上皮细胞及肺泡细胞。sars-cov-2的囊膜蛋白即刺突蛋白(spike protein,s)是一种糖蛋白，主要作用于细胞粘附和细胞膜融合。
[0003]
s蛋白由s1和s2两个亚基组成，其中s1亚基中包含受体结合结构域(receptor binding domain,rbd)介导吸附作用，s2亚基主要体现融合活性。rbd与细胞表面血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ace2)结合，是病毒和受体相互作用以及病毒入侵细胞的关键因素。rbd是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。由于目前没有效果非常好的药物、治疗性抗体、疫苗等用于sars-cov-2病毒感染的治疗和预防，因此开发针对sars-cov-2病毒的疫苗对于健康人的保护及应对病毒的再次爆发是至关重要的。然而，将病毒的全长蛋白作为临床使用的抗原可以引起部分的对于病毒的预防作用，但也常见到临床报道有抗体依赖性增强(antibody-dependent enhancement，简称ade)作用，从而产生比未用疫苗者更加严重的病毒感染。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用，本发明将新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域单独进行跨膜的细胞表达，避免了其它s蛋白表位导致的抗体依赖性增强的风险，再将新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域与跨膜蛋白结构域融合后，在动物体内诱发出更佳的中和滴度。
[0005]
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0006]
本发明提供了一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0007]
1)将序列通过bsu36i和bmgbi双酶切位点整合到pb-713质粒中，得到pb-s-rbd-ngfr质粒；所述序列的核苷酸序列如seq id no.1所示；
[0008]
2)将所述步骤1)得到的pb-s-rbd-ngfr质粒电转化到k562细胞中，经嘌呤霉素筛选，当活细胞比例持续大于80％时，得到跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞。
[0009]
优选的，所述步骤2)嘌呤霉素筛选时的使用浓度为5μg/ml。
[0010]
优选的，所述步骤2)电转化的条件包括：560v、30ms。
[0011]
优选的，所述步骤2)pb-s-rbd-ngfr质粒的质量与k562细胞的数量比为10μg:1
×
10
7
cells。
[0012]
优选的，所述步骤2)筛选的时间在7d以上。
[0013]
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述的制备方法制备得到的跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞，所述细胞的细胞膜上表达信号肽、新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域和跨膜蛋白结构域；
[0014]
所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列如srq id no.3所示，所述跨膜蛋白结构域的氨基酸序列如seq id no.4所示。
[0015]
优选的，编码信号肽的核苷酸序列如seq id no.5所示。
[0016]
优选的，编码新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的核苷酸序列如seq id no.6所示。
[0017]
优选的，编码跨膜蛋白结构域的核苷酸序列如seq id no.7所示。
[0018]
本发明还提供了上述技术方案所述的细胞在制备新型冠状病毒的细胞疫苗中的应用。
[0019]
本发明的有益效果：
[0020]
与新型冠状病毒刺突糖蛋白或者表达该蛋白天然构象的细胞比较，使用本发明提供的制备方法制备得到的细胞免疫动物，可以诱导出更高滴度的中和抗体。这种效果源自：
[0021]
1、新型冠状病毒刺突糖蛋白中s1亚基内部包含受体结合域rbd，介导病毒与宿主细胞受体血管紧张素转化酶2结合吸附和侵入过程。rbd免疫原性强，在诱导中和抗体方面效果突出，故细胞疫苗选择rbd进一步优化和表达。
[0022]
2、表达rbd强度高。在细胞感染新型冠状病毒时，或转染新型冠状病毒基因到细胞中时，可以检测到细胞表面有s蛋白表达。但天然s蛋白为三聚体，跨膜表达能力较差。将s蛋白中rbd结构和有seq id no.4氨基酸序列的跨膜蛋白结构域融合表达时，跨膜表达rbd效率更高。
[0023]
3、由于表达rbd强度高于s蛋白天然跨膜结构，因此与新型冠状病毒刺突糖蛋白或者表达该蛋白天然构象的细胞比较，使用这种细胞免疫动物，可以诱导出更高滴度的中和抗体。
附图说明
[0024]
图1为western-blot结果(exposure_120.0s)；
[0025]
图2为ngfr-rna胶图；
[0026]
图3为rbd-ngfr-rna胶图；
[0027]
图4为电转24h k562-ngfr表达情况，a.k562野生型；b.电转rbd-ngfr的24h后的k562；c.电转ngfr的24h后的k562；
[0028]
图5为电转24h k562-rbd表达情况，a.k562野生型；b.电转ngfr的24h后的k562；c.电转rbd-ngfr的24h后的k562；
[0029]
图6为k562细胞电转4种新型质粒标签的表达结果；
[0030]
图7为k562细胞电转4种新型质粒s-rbd的表达结果；
[0031]
图8为抗体igg的elisa检测，a，以新型冠状病毒刺突蛋白全长蛋白进行elisa检测，b，以新冠冠状病毒结合结构域进行elisa检测；
[0032]
图9为pb-s-rbd-ngfr质粒的结构图；
[0033]
图10为嵌合蛋白的结构图。
具体实施方式
[0034]
本发明提供了一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0035]
1)将序列通过bsu36i和bmgbi双酶切位点整合到pb-713质粒中，得到pb-s-rbd-ngfr质粒；所述序列的核苷酸序列如seq id no.1所示；
[0036]
2)将所述步骤1)得到的pb-s-rbd-ngfr质粒电转化到k562细胞中，经嘌呤霉素筛选，当活细胞比例持续大于80％时，得到跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞。
[0037]
本发明将序列通过bsu36i和bmgbi双酶切位点整合到pb-713质粒中，得到pb-s-rbd-ngfr质粒；所述序列的核苷酸序列如seq id no.1所示。在本发明中，所述序列的核苷酸序列如seq id no.1所示，具体如下：
[0038][0039][0040]
在本发明中，seq id no.1序列中，下划线为pb-713质粒的原始序列，加粗的序列为bsu36i-酶切后补足的ef1启动子序列，斜体序列为编码信号肽的核苷酸序列，双下划线序列为编码新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的核苷酸序列，波浪线的序列为编码跨膜蛋白结构域的核苷酸序列。在本发明中，编码信号肽的核苷酸序列引导细胞表达出的嵌合蛋白(即新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域融合跨膜蛋白结构域)移动到细胞膜上，s蛋白的rbd区域是抗原(缩写为s-rbd)，诱导中和抗体产生，编码跨膜蛋白结构域的核苷酸序列为去除胞内区的蛋白片段，让嵌合蛋白可以附着在细胞膜上。
[0041]
在本发明中，所述pb-713质粒采用市售产品即可，如购买于sbi公司。本发明对序列通过bsu36i和bmgbi双酶切位点整合到pb-713质粒中的方法没有特殊限定，本领域技术
人员依据常规技术操作即可。在本发明中，制备得到的pb-s-rbd-ngfr质粒优选进行大量抽提和去除内毒素后再进行后续操作。在本发明中，所述pb-s-rbd-ngfr质粒的结构图如图9所示。
[0042]
本发明将得到的pb-s-rbd-ngfr质粒电转化到k562细胞中，经嘌呤霉素筛选，当活细胞比例持续大于80％时，得到跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞。
[0043]
本发明对所述k562细胞的来源没有特殊限定，采用市售即可。在本发明中，所述电转化的条件优选包括：560v、30ms。在本发明中，所述pb-s-rbd-ngfr质粒的质量与k562细胞的数量比优选为10μg:1
×
10
7
cells。在本发明中，所述嘌呤霉素筛选时的使用浓度优选为5μg/ml，所述筛选的时间优选在7d以上。本发明对电转化的其它条件如使用的培养基等没有特殊限定，本领域技术人员依据常规操作即可。
[0044]
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述的制备方法制备得到的跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞，所述细胞的细胞膜上表达信号肽、新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域和跨膜蛋白结构域；所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列如srq id no.3所示，所述跨膜蛋白结构域的氨基酸序列如seq id no.4所示。
[0045]
在本发明中，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.2所示，具体如下：
[0046]
mgagatgramdgprlllllllgvslgga。
[0047]
在本发明中，所述新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列如seq id no.3所示，具体如下：
[0048]
rvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfdykddddk。
[0049]
在本发明中，所述跨膜蛋白结构域(简称ngfr)的氨基酸序列如seq id no.4所示，具体如下：
[0050]
trkeacptglythsgecckacnlgegvaqpcganqtvcepcldsvtfsdvvsatepckpctecvglqsmsapcveaddavcrcaygyyqdettgrceacrvceagsglvfscqdkqntvceecpdgtysdeanhvdpclpctvcedterqlrectrwadaeceeipgrwitrstppegsdstapstqepeappeqdliastvagvvttvmgssqpvvtrgttdnlipvycsilaavvvglvayiafkr。
[0051]
在本发明中，信号肽引导细胞表达出的嵌合蛋白(即冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域融合跨膜蛋白结构域)移动到细胞膜上，s蛋白的rbd区域是抗原(缩写为s-rbd)，诱导中和抗体产生，跨膜蛋白结构域去除胞内区的蛋白片段，让嵌合蛋白可以附着在细胞膜上。在本发明中，所述嵌合蛋白的结构如图10所示。
[0052]
在本发明中，编码信号肽的核苷酸序列如seq id no.5所示，具体如下：
[0053]
ccgccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctgaactgcgtccgccgtctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgtccggcgctcccttggagcctacctagactcagccggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaactctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttacagatccaagctgtgaccggcgcctac。
[0054]
在本发明中，编码新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的核苷酸序列如
seq id no.6所示，具体如下：
[0055]
agagtgcagcccacagagagcattgtgagattccccaacatcaccaacctgtgcccctttggggaggtgttcaatgccacaagatttgcctctgtgtatgcctggaacagaaagagaatcagcaactgtgtggctgactactctgtgctctataattctgctagcttcagcaccttcaagtgctatggggtgagccccaccaagctgaatgacctgtgcttcaccaatgtgtatgctgacagctttgtgatcagaggggatgaggtgagacagattgcccctgggcagactggcaagattgctgactacaactacaagctgcctgatgacttcactggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggacagcaaggtggggggcaactacaactacctctatagactgttcagaaagagcaacctgaagccctttgagagagacatcagcacagagatctaccaagctggcagcaccccctgcaatggggtggagggcttcaactgctacttccccctgcagagctatggctttcagcccaccaatggggtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagctttgagctgctgcatgcccctgccacagtgtgtggccccaagaagagcaccaacctggtgaagaacaagtgtgtgaactttgactacaaggatgatgatgacaag。
[0056]
在本发明中，编码跨膜蛋白结构域的核苷酸序列如seq id no.7所示，具体如下：
[0057]
cacacagcggtgagtgctgcaaagcctgcaacctgggcgagggtgtggcccagccttgtggagccaaccagaccgtgtgtgagccctgcctggacagcgtgacgttctccgacgtggtgagcgcgaccgagccgtgcaagccgtgcaccgagtgcgtggggctccagagcatgtcggcgccgtgcgtggaggccgacgacgccgtgtgccgctgcgcctacggctactaccaggatgagacgactgggcgctgcgaggcgtgccgcgtgtgcgaggcgggctcgggcctcgtgttctcctgccaggacaagcagaacaccgtgtgcgaggagtgccccgacggcacgtattccgacgaggccaaccacgtggacccgtgcctgccctgcaccgtgtgcgaggacaccgagcgccagctccgcgagtgcacacgctgggccgacgccgagtgcgaggagatccctggccgttggattacacggtccacacccccagagggctcggacagcacagcccccagcacccaggagcctgaggcacctccagaacaagacctcatagccagcacggtggcaggtgtggtgaccacagtgatgggcagctcccagcccgtggtgacccgaggcaccaccgacaacctcatccctgtctattgctccatcctggctgctgtggttgtgggccttgtggcctacatagccttcaagagg。
[0058]
本发明还提供了上述技术方案所述的细胞在制备新型冠状病毒的细胞疫苗中的应用。本发明对所述细胞制备成细胞疫苗的方法没有特殊限定，采用常规制备细胞疫苗的方法即可。本发明对所述细胞疫苗的使用方法没有特殊限定。
[0059]
实施例1
[0060]
通过上游bsu36i和下游bmgbi双酶切位点，将seq id no.1的核苷酸序列整合进入pb-713质粒(购自sbi公司)。新质粒命名为pb-s-rbd-ngfr质粒。由金唯智对制备成的质粒进行大量抽提和去除内毒素。
[0061]
细胞的转染：
[0062]
1.k562细胞按照atcc的说明书进行培养，培养条件为：imdm+10％fbs。传代方法：维持细胞浓度在1
×
10
5
～1
×
10
6
/ml，每2～3天离心去除旧培养基，按密度将细胞悬浮于新鲜培养基。
[0063]
2.使用celetrix电转仪，按照使用说明书对k562细胞进行质粒电转，取4
×
10
7
的k562细胞，分4个120μl电击管，也就是说1
×
10
7
cells/管，各加10μg的pb-s-rbd-ngfr质粒，电转条件为：560v、30ms。随后取出细胞继续按原条件养。
[0064]
3.电转48h后，细胞取1ml通过流式检测ngfr的表达量，然后在原培养基基础上，加入嘌呤霉素到5μg/ml的浓度进行药筛。
[0065]
4.药物筛选7天，每天通过cellometer x2细胞计数仪，按照说明书中方法进行细
胞活力测定，当活细胞比例可持续大于80％时，即获得转入s-rbd-ngfr的稳定细胞池称k562-s-rbd-ngfr(即跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞)。
[0066]
通过流式分析检测k562-s-rbd-ngfr中s-rbd的表达量。使用野生型k562细胞作为流式细胞术的阴性对照，当设门策略为阴性对照细胞表达量小于1％时，k562-s-rbd-ngfr细胞的阳性率应为50％以上。
[0067]
实施例2
[0068]
一、实验目的
[0069]
rbd-ngfr结构的聚集体情况。
[0070]
二、实验材料
[0071]
1.样品
[0072]
k562-细胞；实施例1制备的k562-s-rbd-ngfr细胞
[0073]
2.试剂
[0074]
表1试剂
[0075][0076]
3.仪器
[0077]
表2仪器
[0078][0079][0080]
二、实验方法
[0081]
(一)蛋白样品的提取
[0082]
1.取细胞培养液于15ml离心管中，1200rpm离心5min，弃上清，加入1ml 1
×
pbs液重悬，2000rpm离心5min，离心洗涤两次；
[0083]
2.取一1.5ml的ep管，加入5μl 100
×
phosphatase inhibitor蛋白抑制剂和495μl pierce
tm
ripabuffer蛋白裂解液，旋涡振荡器上充分混匀后备用；
[0084]
3.轻轻弃上清，用移液枪将上清尽量全部弃干净，加入100μl上述混合液重悬后，冰浴孵育15min，4℃预冷，12000rpm离心15min，取上清至1.5ml ep管中。
[0085]
(二)bca法测样品蛋白浓度
[0086]
1.配制bca工作液(bca工作液室温下24h内稳定，故现用现配)：将a液和b液摇晃混匀，按照a：b＝50：1的比例配制bca工作液，充分混匀；
[0087]
2.配制不同浓度的标准蛋白液(bsa)：0μg/μl(空白组)、0.3125μg/μl、0.125μg/μl、0.5μg/μl以及2μg/μl；
[0088]
3.取不同浓度的标准蛋白液以及待测的蛋白样品各5μl加入96孔板中，向各孔的蛋白液中加入200μl的bca工作液(加样时应当动作轻柔，防止产生气泡影响读数)，混匀后，37℃放置30min进行静置；
[0089]
4.静置结束，冷却至室温后，用酶标仪在562nm处测定吸光度值，并制作标准曲线，根据待测样品的吸光度值，比对标准曲线，计算待测蛋白样品的浓度。
[0090]
(三)sds-page电泳
[0091]
1.样品的制备：
[0092]
a、取80μl裂解的蛋白样品于1.5ml ep管中，加入20μl 5
×
lane marker loading buffer混匀；
[0093]
b、取60μl裂解的蛋白样品于1.5ml ep管中，加入20μl 4
×
非变性蛋白上样缓冲液混匀；
[0094]
c、金属浴105℃煮沸10min，12000rpm/min离心1min；
[0095]
2、加样：在电泳槽里加入电极缓冲液，样品的加样量如表3所示(20μg/孔)；
[0096]
表3sds-page电泳的加样量(tris-glycine胶，10％，10孔)
[0097]
泳道样品加样量/μl1marker10.02k562-对照3.43k562-s-rbd-ngfr-变性4.141
×
lane marker loading buffer5.05k562-s-rbd-ngfr-非变性4.36s1-rbd蛋白(40ng)10.0
[0098]
3.设置电泳仪参数(120v，70min)，进行sds-page电泳。
[0099]
(四)转印
[0100]
1.膜处理：电泳期间将pvdf膜置于无水甲醇浸泡30s-1min进行活化，之后置于1
×
eblot l1pvdf膜平衡液中浸泡进行平衡备用；
[0101]
2.电泳结束取出胶后置于超纯水中，用超纯水清洗一下；
[0102]
3.转印：按照海绵
→
胶
→
pvdf膜
→
海绵的顺序从上往下依次放置于eblot快速转膜仪上，每层放好后，都需要用试管赶去气泡，装配好eblot快速转膜仪，设置好参数(24v，11min)，进行转印；
[0103]
4.转印结束后，将pvdf膜取出，置于封闭液中，室温摇床封闭2h。
[0104]
(五)抗体孵育
[0105]
1.一抗的稀释：用封闭液按1：1000的比例稀释抗体兔多抗40592-t62 sars-cov-2/2019-ncov spike/rbd antibody rabbit pab(20200827回收)，混匀后备用，
[0106]
2.一抗的孵育：将pvdf膜置于一抗稀释液中，4℃冰箱摇床孵育过夜；
[0107]
3.一抗稀释液的回收：将一抗稀释液回收至50ml离心管中，4℃冰箱保存备用；
[0108]
4.加入1
×
tbst进行洗膜，5min
×
5次；
[0109]
5.二抗的稀释：用封闭液按1：10000的比例稀释抗体兔二抗；
[0110]
6.二抗的孵育：将pvdf膜置于上述二抗稀释液中，室温摇床孵育1h；
[0111]
7.加入1
×
tbst进行洗膜，3min
×
4次；
[0112]
8.加入1
×
tbs进行洗膜，3min
×
1次。
[0113]
(六)免疫印迹
[0114]
1.显色液的配制(现配现用)：按照化学发光液-：化学发光液-＝1：1的比例配制，用超纯水进行1：1稀释；
[0115]
2.将pvdf膜置于显色液中，立即进行后续实验；
[0116]
3.显影：在凝胶成像分析系统上拍照，观察并分析结果。
[0117]
三、实验结果与讨论
[0118]
1.样品的蛋白浓度
[0119]
bca法测定样品的蛋白浓度结果如表4所示。
[0120]
表4样品蛋白浓度测定结果
[0121]
样品浓度(mg/ml)k562-对照7.475k562-s-rbd-ngfr6.150
[0122]
2、western-blot结果
[0123]
western-blot的实验结果如图1所示。由图1可知，还原与非还原状态下，k562细胞中均有s-rbd-ngfr的表达，且二者条带位置相差一倍左右，分子量大小与预期相符，表明ngfr存在三聚体。
[0124]
实施例3
[0125]
一、实验材料
[0126]
1.细胞：k562细胞
[0127]
2.核酸：质粒：rbd in ngfr in pb713、ngfr in pb713
[0128]
3.抗体：anti-1p-pe(博奥龙)
[0129]
anti-human-igg-fc(博奥龙)
[0130]
anti-ngfr-pe(博奥龙)
[0131]
4.试剂：max dna polymerase(takara r045a)
[0132]
gel extraction kit(omaga d2500-03)
[0133]
琼脂糖(invitrogen 75510-019)
[0134]
mmessage t7ultra kit(thermo am1345)
[0135]
imdm培养基(含10％fbs)
[0136]
5.仪器：pcr仪(bio-rad t100)
[0137]
电泳仪(bio-rad powerpac hc)
[0138]
凝胶成像仪(bio-rad universal hood
ꢀⅱ
)
[0139]
高速台式离心机(gene 1730r)
[0140]
水浴锅(上海博讯hhs-11-2)
[0141]
酶标仪(thermo 1510)
[0142]
电转仪(流式细胞仪(bd fortessa)
[0143]
二、实验方法
[0144]
1.dna的获得
[0145]
1)快速基因合成：
[0146]
委托金唯智快速合成基因ngfr，将基因通过5'bsu36i and 3'bmgbi(使用重组的方法)克隆至载体pb713(ampicillin)，构建质粒ngfr in pb713，序列如下:
[0147]
seq id no.8：
[0148]
cctgaggccgccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctgaactgcgtccgccgtctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgtccggcgctcccttggagcctacctagactcagccggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaactctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttacagatccaagctgtgaccggcgcctacgctagacgccaccgaattcatgggggcaggtgccaccggccgcgccatggacgggccgcgcctgctgctgttgctgcttctgggggtgtcccttggaggtgccaaggaggcatgccccacaggcctgtacacacacagcggtgagtgctgcaaagcctgcaacctgggcgagggtgtggcccagccttgtggagccaaccagaccgtgtgtgagccctgcctggacagcgtgacgttctccgacgtggtgagcgcgaccgagccgtgcaagccgtgcaccgagtgcgtggggctccagagcatgtcggcgccgtgcgtggaggccgacgacgccgtgtgccgctgcgcctacggctactaccaggatgagacgactgggcgctgcgaggcgtgccgcgtgtgcgaggcgggctcgggcctcgtgttctcctgccaggacaagcagaacaccgtgtgcgaggagtgccccgacggcacgtattccgacgaggccaaccac
gtggacccgtgcctgccctgcaccgtgtgcgaggacaccgagcgccagctccgcgagtgcacacgctgggccgacgccgagtgcgaggagatccctggccgttggattacacggtccacacccccagagggctcggacagcacagcccccagcacccaggagcctgaggcacctccagaacaagacctcatagccagcacggtggcaggtgtggtgaccacagtgatgggcagctcccagcccgtggtgacccgaggcaccaccgacaacctcatccctgtctattgctccatcctggctgctgtggttgtgggccttgtggcctacatagccttcaagaggctcgaggagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtg。
[0149]
委托金唯智优化并快速合成基因rbd，将基因通过5'bsrgi and 3'bsrgi(使用重组的方法)克隆至载体ngfr in pb713(ampicillin)，构建质粒rbd in ngfr in pb713，序列如下：
[0150]
seq id no.9：
[0151]
tgtacagtcgacagagtgcagcccacagagagcattgtgagattccccaacatcaccaacctgtgcccctttggggaggtgttcaatgccacaagatttgcctctgtgtatgcctggaacagaaagagaatcagcaactgtgtggctgactactctgtgctctataattctgctagcttcagcaccttcaagtgctatggggtgagccccaccaagctgaatgacctgtgcttcaccaatgtgtatgctgacagctttgtgatcagaggggatgaggtgagacagattgcccctgggcagactggcaagattgctgactacaactacaagctgcctgatgacttcactggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggacagcaaggtggggggcaactacaactacctctatagactgttcagaaagagcaacctgaagccctttgagagagacatcagcacagagatctaccaagctggcagcaccccctgcaatggggtggagggcttcaactgctacttccccctgcagagctatggctttcagcccaccaatggggtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagctttgagctgctgcatgcccctgccacagtgtgtggccccaagaagagcaccaacctggtgaagaacaagtgtgtgaactttgactacaaggatgatgatgacaagacgcgtaaggaggcatgccccacaggcctgtaca。
[0152]
2)pcr扩增：
[0153]
基于之前构建的质粒ngfr in pb713和rbd in ngfr in pb713设计引物。
[0154]
rbd-ngfr线性化模板扩增引物:其中加粗部分为t7启动子
[0155]
primer forward(seq id no.10)：
[0156][0157]
primer reverse(seq id no.11)：caccgtgggcttgtactc
[0158]
ngfr线性化模板扩增引物：
[0159]
primer forward(seq id no.12)：
[0160][0161]
primer reverse(seq id no.13)：caccgtgggcttgtactc
[0162]
委托金唯智合成引物。在超净台中按照引物外侧推荐量加入适量的ddh
2
o，使引物浓度达到10nm。用质粒ngfr in pb713和rbd in ngfr in pb713作为模板，参考primer star master mix(宝生物)试剂说明书，按照下表配置pcr扩增体系。
[0163]
表5pcr扩增体系
[0164]
模板1μlprimer f5μlprimer r5μlprimer star master mix50μlddh
2
oto 100μl
[0165]
然后在pcr仪上运行以下反应体系，获得体外转录的线性化模板。
[0166]
表6反应体系
[0167][0168]
ngfr线性化pcr产物序列如下(seq id no.14)，其中加粗序列为t7启动子区，斜体序列为引物序列：
[0169][0170]
rbd-ngfr线性化pcr产物序列如下(seq id no.15)，其中加粗序列为t7启动子区，斜体序列为引物序列：
[0171][0172]
扩增结束后，将所得rbd-ngfr、ngfr的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，130v，电泳30min。
[0173]
3)胶回收
[0174]
按照gel extraction kit(omaga)对上述pcr产物进行胶回收，具体步骤如下：
[0175]
a.按照预测目的条带大小切除胶块，放入1.5ml ep管中，称重；
[0176]
b.按照0.3g胶块加入0.3ml binding buffer的量加入适当体积的binding buffer，置55-65℃，6-8min，或胶块完全融化，将ep管内溶液转移至吸附柱内，12000rpm，离心1min，弃掉下层废液；
[0177]
c.在吸附柱内加300ul binding buffer，12000rpm，离心1min，弃掉下层废液；
[0178]
d.在吸附柱内加600ul spw wash buffer，12000rpm，离心1min，弃掉下层废液；
[0179]
e.重复步骤d；
[0180]
f.将空的吸附柱置于离心机中，12000rpm，离心2min，去掉残余的洗脱液；
[0181]
g.取30μl elution buffer悬浮滴于吸附柱上，室温静置2min，12000rpm，离心1min，得到体外转录的线性化模板，取2μl产物在酶标仪(thermo)上进行浓度测定。
[0182]
2.体外转录
[0183]
按照mmessage t7ultra kit(thermo)试剂盒说明书，取rbd-ngfr和ngfr的线性化模板dna各1μg进行体外转录，具体步骤如下：
[0184]
1)反应体系：
[0185]
表7反应体系
[0186][0187][0188]
混匀，37℃水浴过夜反应；
[0189]
2)加1μl turbo dnase，混匀，37℃反应15min，消化dna模板，得到rbd-ngfr和ngfr的mmessaget7ultra reaction。
[0190]
3.加尾
[0191]
按照mmessaget7ultra kit(thermo)试剂盒说明书，将上述所得rbd-ngfr和ngfr的mmessage t7ultra reaction配置如下体系，进行加尾，具体步骤如下：
[0192]
1)反应体系：
[0193]
表8反应体系
[0194][0195]
2)从上述反应体系中取出2.5μl反应液作为加尾反应的对照；
[0196]
3)加4μl of e-pap，混匀，加水使最终反应体系为100μl；
[0197]
4)37℃反应30-45min，反应结束后将产物置于冰上。
[0198]
4.licl沉淀
[0199]
按照mmessaget7ultra kit(thermo)试剂盒说明书，将上述所得rbd-ngfr和ngfr的加尾产物用licl沉淀的方法进行纯化，具体步骤如下：
[0200]
1)通过加入50μl licl precipitation solution，混匀终止反应；
[0201]
2)在-20℃放置≥30min；
[0202]
3)最高转速，4℃离心15min，沉淀rna；
[0203]
4)小心弃去上清，用1ml 70％乙醇漂洗，重新离心；
[0204]
5)小心弃去上清，用适当体积的nuclease-free water重新溶解rna，得到rbd-ngfr-rna和ngfr-rna，取出3μl进行浓度测定和琼脂糖凝胶电泳分析；
[0205]
6)将所得rbd-ngfr-rna和ngfr-rna在-20℃或-70℃保存。
[0206]
5.电转表达
[0207]
1)取2*10
7
k562细胞悬液(细胞密度约1*10
6
cells/ml)于50ml离心管中，400*g离心5min，弃上清；
[0208]
2)取20ml 1640无血清培养基重悬细胞，去除血清的干扰，400*g离心5min，弃上清；
[0209]
3)取2ml 1640无血清培养基重悬细胞，分别取1ml细胞悬液到1.5mlep管中，400*g离心5min，弃上清；
[0210]
4)轻弹ep管底部使细胞呈糊状，分别加入适量的rna(rbd-ngfr 6μl，18μg；ngfr6μl,15μg)，加1640无血清培养基至140ul体系，混匀，将细胞悬液转移至电击杯中，避免产生气泡；
[0211]
5)启动电转仪，设置参数：560v，30ms，将电击杯快速放入电击槽中，进行电转，电击完成后快速插入冰中，静置2min；
[0212]
6)将细胞悬液转移至75ml细胞培养瓶中，补加30ml imdm培养基(含10％fbs)，37℃恒温培养箱中培养，得到ngfr-k562、rbd-ngfr-k562细胞悬液。
[0213]
6.流式检测
[0214]
1)实验一：1p+anti-human-igg-fc
[0215]
a.将上一步电转后的ngfr-k562、rbd-ngfr-k562细胞于37℃恒温培养箱中培养24h后，于生物安全柜中取出1*10
6
k562(野生型)、ngfr-k562、rbd-ngfr-k562细胞，400*g离心5min，弃上清；用1ml pbs溶液洗一次，400*g离心5min，弃上清；
[0216]
b.在细胞沉淀中加1μl 1p抗体和100μl pbs溶液，轻弹流式管底部混匀，室温孵育
40min；
[0217]
c.加1ml pbs溶液洗去一抗，400*g离心5min，弃上清；
[0218]
d.在细胞沉淀中加2μl anti-human-igg-fc和100μl pbs溶液，室温孵育30min；
[0219]
e.加1ml pbs溶液洗去一抗，400*g离心5min，弃上清；
[0220]
f.加300μl pbs上机检测；
[0221]
2)实验二：anti-ngfr-pe
[0222]
a.将上一步电转后的ngfr-k562、rbd-ngfr-k562细胞于37℃恒温培养箱中培养24h后，于生物安全柜中取出1*106 k562(野生型)、ngfr-k562、rbd-ngfr-k562细胞，400*g离心5min，弃上清；用1ml pbs溶液洗一次，400*g离心5min，弃上清；
[0223]
b.在细胞沉淀中加1.5μl 1p anti-ngfr-pe和100ul pbs溶液，轻弹流式管底部混匀，室温孵育30min；
[0224]
c.加1ml pbs溶液洗去抗体，400*g离心5min，弃上清；
[0225]
d.加300μl pbs溶液上机检测。
[0226]
3)流式细胞仪上机检测
[0227]
表9检测条件
[0228]
通道电压值(v)fsc82ssc257pe353
[0229]
三、实验结果与讨论
[0230]
1.dna的获得
[0231]
线性化模板的浓度如下表所示：
[0232]
表10线性化模板的浓度
[0233]
ngfr438ng/μlrbd-ngfr240ng/μl
[0234]
2.加尾
[0235]
图2、图3分别是ngfr-rna和rbd-ngfr-rna的琼脂糖凝胶电泳图，图像显示成功制备到rna，且加尾后条带有所上移。但rbd-ngfr-rna有些许拖尾和弥散，且相比加尾前大小基本没有改变。
[0236]
下表是ngfr-rna和rbd-ngfr-rna的浓度。
[0237]
表11ngfr-rna、rbd-ngfr-rna的浓度
[0238]
rna浓度260/280纯度ngfr2383ng/μl2.38rbd-ngfr3144ng/μl2.44
[0239]
3.流式检测
[0240]
图4为电转ngfr-rna和rbd-ngfr-rna的24h培养后的k562表达ngfr情况，结果显示，与k562野生型相比，电转ngfr的24h后的k562ngfr的表达率为99.6％，电转rbd-ngfr的24h后的k562ngfr的表达率为97.6％。
[0241]
表12 24h k562-ngfr表达情况
[0242]
样本名称表达率k562092％rbd-ngfr97.6％ngfr99.6％
[0243]
图5为电转ngfr-rna和rbd-ngfr-rna的24h培养后的k562表达rbd情况，结果显示，k562野生型和电转ngfr的24h后的k562rbd的表达率均为5％左右，而电转rbd-ngfr的24h后的k562 rbd的表达率为59.7％。
[0244]
表13 24h k562-rbd表达情况
[0245]
样本名称表达率k5625.04％ngfr5.46％rbd-ngfr59.7％
[0246]
结果表明：rbd-ngfr-rna可以在k562细胞上进行表达。
[0247]
对比例1
[0248]
一、实验材料
[0249]
1.细胞：k562细胞、0330b细胞
[0250]
2.培养基：imdm完全培养基、1640完全培养基(含150iu/ml的il-2)
[0251]
3.流式抗体：
[0252]
anti-human-igg-fc-pe
[0253]
anti-protien s-1p(博奥龙公司2mg/ml、识别s-rbd区域)
[0254]
4.质粒：
[0255]
分别基因合成(委托金唯智生物科技有限公司)
[0256]
pdgfr基因片段(seq id no.16)
[0257]
gctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgt。
[0258]
cd4基因片段(seq id no.17)
[0259]
acgcgtaaaatagacatcgtggtgctagctttccagaaggcctccagcatagtctataagaaagagggggaacaggtggagttctccttcccactcgcctttacagttgaaaagctgacgggcagtggcgagctgtggtggcaggcggagagggcttcctcctccaagtcttggatcacctttgacctgaagaacaaggaagtgtctgtaaaacgggttacccaggaccctaagctccagatgggcaagaagctcccgctccacctcaccctgccccaggccttgcctcagtatgctggctctggaaacctcaccctggcccttgaagcgaaaacaggaaagttgcatcaggaagtgaacctggtggtgatgagagccactcagctccagaaaaatttgacctgtgaggtgtggggacccacctcccctaagctgatgctgagcttgaaactggagaacaaggaggcaaaggtctcgaagcgggagaaggcggtgtgggtgctgaaccctgaggcggggatgtggcagtgtctgctgagtgactcgggacaggtcctgctggaatccaacatcaaggttctgcccacatggtcgaccccggtgcagccaatggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttctgtgtcaggtgccggcac。
[0260]
msln基因片段(seq id no.18)
[0261]
gaagtggagaagacagcctgtccttcaggcaagaaggctcccgagatagacgagagcctcatcttctacaagaagtgggagctggaagcctgcgtggatgcggccctgctggccacccagatggaccgcgtgaacgccatccccttcacctacgagcagctggacgtcctaaagcataaactggatgagctctacccacaaggttaccccgagtctgtgatccagcacctgggctacctcttcctcaagatgagccctgaggacattcgcaagtggaatgtgacgtccctggagaccctgaaggctttgcttgaagtcaacaaagggcacgaaatgagtcctcaggtggccaccctgatcgaccgctttgtgaagggaaggggccagctagacaaagacaccctagacaccctgaccgccttctaccctgggtacctgtgctccctcagccccgaggagctgagctccgtgccccccagcagcatctgggcggtcaggccccaggacctggacacgtgtgacccaaggcagctggacgtcctctatcccaaggcccgccttgctttccagaacatgaacgggtccgaatacttcgtgaagatccagtccttcctgggtggggcccccacggaggatttgaaggcgctcagtcagcagaatgtgagcatggacttggccacgttcatgaagctgcggacggatgcggtgctgccgttgactgtggctgaggtgcagaaacttctgggaccccacgtggagggcctgaaggcggaggagcggcaccgcccggtgcgggactggatcctacggcagcggcaggacgacctggacacgctggggctggggctacagggcggcatccccaacggctacctggtcctagacctcagcatgcaagaggccctctcg。
[0262]
替换pb-s-rbd-ngfr质粒中的基因(seq id no.19)：
[0263]
acacacagcggtgagtgctgcaaagcctgcaacctgggcgagggtgtggcccagccttgtggagccaaccagaccgtgtgtgagccctgcctggacagcgtgacgttctccgacgtggtgagcgcgaccgagccgtgcaagccgtgcaccgagtgcgtggggctccagagcatgtcggcgccgtgcgtggaggccgacgacgccgtgtgccgctgcgcctacggctactaccaggatgagacgactgggcgctgcgaggcgtgccgcgtgtgcgaggcgggctcgggcctcgtgttctcctgccaggacaagcagaacaccgtgtgcgaggagtgccccgacggcacgtattccgacgaggccaaccacgtggacccgtgcctgccctgcaccgtgtgcgaggacaccgagcgccagctccgcgagtgcacacgctgggccgacgccgagtgcgaggagatccctggccgttggattacacggtccacacccccagagggctcggacagcacagcccccagcacccaggagcctgaggcacctccagaacaagacctcatagccagcacggtggcaggtgtggtgaccacagtgatgggcagctcccagcccgtggtgacccgaggcaccaccgacaacctcatccctgtctattgctccatcctggctgctgtggttgtgggccttgtggcctacatagccttcaagagg。
[0264]
制备质粒，分别命名为s-rbd-pdgfr、s-rbd-cd4、s-rbd-msln。由金唯智对制备成的质粒进行大量抽提和去除内毒素。
[0265]
二、实验方法
[0266]
1.取4
×
10
7
的k562细胞分别电转10μg的s-rbd-ngfr、s-rbd-pdgfr、s-rbd-cd4、s-rbd-msln四种质粒，电转条件为：1
×
10
7
cells/管、120μl电击管、560v、30ms。
[0267]
2.电转48h后，每种细胞各取1ml通过流式检测4种标签的表达量，然后用5μg/ml的嘌呤霉素进行药筛。一周后，通过流式分析检测k562-s-rbd-ngfr、k562-s-rbd-pdgfr、k562-s-rbd-cd4、k562-s-rbd-msln四种细胞膜上s-rbd的表达量。
[0268]
结果见图6和图7。流式分析结果表明：k562细胞电转4种新型质粒(s-rbd-ngfr、s-rbd-pdgfr、s-rbd-cd4、s-rbd-msln)后均可表达s-rbd(图7)，并且在用5ug/ml的嘌呤霉素药筛一周后k562-s-rbd-ngfr细胞s-rbd表达量高达98.4％，远远超过嘌呤霉素的跨膜表达量。
[0269]
对比例2
[0270]
一、实验材料
[0271]
1.细胞：k562细胞
[0272]
2.培养基：imdm完全培养基
[0273]
3.elisa抗体：
[0274]
biotinylated2019n-cov spike s-his (kactus公司)
[0275]
s1-rbd(sars-cov-2)(hek293)(北京博奥龙免疫技术有限公司)
[0276]
goa anti-mouse igg-hrp(1:10000)
[0277]
4.小鼠：雌性balb/c小鼠(5周，25g左右)
[0278]
二、实验方法
[0279]
1.将k562-s-rbd-ngfr、k562-s-rbd-pdgfrr、k562-s-rbd-cd4、k562-s-rbd-msln和k562-pzx-k-s-hygro五种细胞各取1
×
10
8
，然后用1ml的pbs重悬细胞。
[0280]
k562-pzx-k-s-hygro的获取：通过悬浮293t细胞(购自中山康晟生物技术有限公司)以阳离子聚合物转染试剂(jetprime，购自polyplus公司)瞬时转染pzx-k-s-hygro慢病毒穿梭质粒(序列如seq id no.20所示)与慢病毒包装辅助质粒(如sbi公司的ppack packaging system，参考其说明书进行转染)后待细胞表达慢病毒并分泌于细胞培养上清中。浓缩收获的病毒上清，沉淀获得高滴度病毒后感染k562细胞，经过含有潮霉素的抗性培养基筛选高表达细胞，构建得到k562-pzx-k-s-hygro细胞。
[0281]
seq id no.20：
[0282]
gtaaaacgacggccagtgccaagctgacgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggaccc
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[0283]
2.动物实验共分六组：
①
pbs组、
②
k562-s-rbd-ngfr组、
③
k562-s-rbd-pdgfr组、
④
k562-s-rbd-cd4组、
⑤
k562-s-rbd-msln组和
⑥
k562-pzx-k-s-hygro组，每组4只小鼠，每支只小鼠注射2
×
10
7
cells。
[0284]
3.14天后每只小鼠取适量血分离血清：将采集的血清放37℃培养箱温浴1h，然后3000rpm离心20min，离心结束后，将上层血清转移到标记好的1.5ml离心管，然后进行elisa检测。
[0285]
4.elisa包被：将s全长蛋白和s-rbd蛋白按照1μg/ml的浓度分别包被3块elisa板，100μl/孔，4℃过夜包被。
[0286]
5.elisa封闭：用tbst配置120ml的5％脱脂牛奶，200μl/孔，37℃培养箱孵育1h。
[0287]
6.elisa上样：将24管血清分别按照1:100、1:1000、1:10000稀释三个梯度，加入到封闭好的elisa板中，每管血清做3次重复，100μl/孔，37℃培养箱孵育2-3h。
[0288]
7.elisa二抗：将goat anti-mouse igg-hrp抗体按照1:10000的比例用pbs稀释60ml，100μl/孔，室温孵育40min。
[0289]
8.elisa显色：每孔加入100μl tmb显色液避光显色5min后再加入100μl终止液。
[0290]
9.酶标仪检测波长为450nm时的od值。
[0291]
如图8所示：与对照组(血清滴度分别为1:1054)相比，k562-pzx-k-s-hygro、k562-s-rbd-ngfr、k562-s-rbd-pdgfr三组细胞均可使小鼠体内产生s-rbd抗体(各组平均血清滴度分别为1:906，1:3218和1:165)，在血清稀释比例为1:10000的条件下依然可以在k562-s-rbd-ngfr组的个别小鼠体内检测到s-rbd抗体，并且其表达量最高。
[0292]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。