树突状细胞疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明属于细胞免疫领域，具体地说是一种树突状细胞疫苗的制备方法，包括从脐血中分离得到脐血单核细胞；从中筛选出DC细胞，培养并扩增，然后进行单表位多聚抗原肽（SEA-MVP）负载，并孵育过夜得到DC疫苗。本发明的有益效果在于选用单表位多聚抗原肽（SEA-MAP）负载DC细胞，单表位多聚抗原肽为体外合成，成份明确单一，纯度高；碱性氨基酸作骨架将单表位连接成，使连接的表位肽的朝向具有一致性易被DC细胞识别呈递，敏感性特异性强，负载有效率高，无免疫耐受；对激活CD4+细胞和CD8+细胞抗肿瘤细胞的能力较现有方法至少提高万倍以上。
【专利说明】树突状细胞疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞免疫领域，具体地说是一种树突状细胞疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002]树突状细胞(Dendriticcells，DC)是体内功能最强的抗原递呈细胞(AntigenpresentingcelI, APC),能够刺激初始的T细胞增殖,启动免疫应答；还能够呈递抗原给MHC-1类限制性CD8+和MHC-1I类限制性CD4+T淋巴细胞，诱导特异性免疫反应，被称为“天然免疫佐剂”，因此在诱导免疫应答中具有独特的地位。近年来，以DC为基础的免疫治疗在临床应用中得到越来越广泛的关注，是国内外研究的热点。
[0003]现有的DC 疫苗制备方法中大多采用肿瘤组织块或癌相关蛋白作为靶向物质，负载有效率低，靶向性较低，特异性较差。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种高负载有效率，高靶向性的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0005]( 1)从脐血中分离得到脐血单核细胞；
[0006](2)用含1%FBS的RPM1-1640培养基贴壁培养脐血单核细胞，去除未贴壁细胞，向贴壁细胞中加入含有GM-CSF (粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子)、IL-4 (白细胞介素_4)、双抗(青霉素加链霉素)和10%FBS的RPM1-1640培养基，继续培养；三天后补加半量的GM-CSF、IL-4、双抗和10%FBS的RPM1-1640培养基；
[0007](3)第 6 天，将细胞混匀，换用含有 1%FBS、GM-CSF, IL-4, IL-6, IL-1 β 和 TNF-α(肿瘤坏死因子_α )的培养基，同时进行单表位多聚抗原肽(SEA-MVP)负载，并孵育过夜；
[0008](4)第7天，进行常规检测后制备DC疫苗注射液。
[0009]优选的，步骤(2)中，加入的GM-CSF浓度为500_1500n/ml，IL-4浓度为200-1000UI/ml, IL-6 浓度为 500-1500UI/ml。
[0010]优选的，步骤(3)中，培养基中GM-CSF浓度为20_100ng/mL，IL-3浓度为50-150ng/mL，双抗浓度为 50-150U/mL，IL-1 β 浓度为 1000_3000UI/ml、TNF-α 浓度为500U1-1500UI/ml。
[0011]优选的，所述单表位多聚抗原肽的加入量为0.5-10mg/ml。
[0012]具体的，步骤(4)包括如下步骤:将促熟后的DC细胞进行离心清洗后吸去上清，用复方电解质注射液重悬细胞沉淀；将细胞沉淀离心后反复清洗3遍；将清洗后的DC细胞用10%的人血白蛋白的复方电解质注射液垂悬，混匀后进行装袋封口，并抽取部分样品进行检测；检测合格后的注射液须在4°C保存，并在24h之内应用。
[0013]本发明的有益效果在于选用单表位多聚抗原肽(SEA-MAP)负载DC细胞，单表位多聚抗原肽为体外合成，成份明确单一，纯度高；碱性氨基酸作骨架将单表位连接成，使连接的表位肽的朝向具有一致性易被DC细胞识别呈递，四分枝或者八分枝的多聚抗原肽单位空间内指数级增加了表位肽的特异性结合能力和反应，敏感性特异性强，负载有效率高，无免疫耐受；对激活CD4+细胞和CD8+细胞抗肿瘤细胞的能力较现有方法至少提高万倍以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1A和图1B为不同培养时间细胞的形态，图1A为促成熟前细胞细胞在倒置显微镜下的形态；图1B为促成熟后细胞在倒置显微镜下的形态；放大倍率均为20 X。
[0015]图2为促成熟后DC细胞中⑶IIC和HLA-DR的流式细胞分析结果。
[0016]图3为促成熟后DC细胞中⑶83的流式细胞分析结果。
[0017]图4为促成熟后DC细胞中⑶86的流式细胞分析结果。
【具体实施方式】
[0018]实施例1脐带血来源的DC的制备
[0019](一)脐血单核细胞分离:
[0020]将脐血袋剪开，用50ml注射器量取脐血，用等量的复方电解质注射液稀释血液；以Ficoll分离液与细胞悬浮液2:3的比例，将稀释好细胞悬浮液缓慢加到Ficoll分离液上层；离心，900g、25min ;吸取分界处白膜附近细胞，复方电解质注射液重悬；离心400g、Smin ;吸去上清，用复方电解质注射液重悬细胞沉淀；离心400g、8min ;吸去上清，细胞沉淀加IOml培养基重悬 后计数；根据计数结果，培养DC。
[0021](二)DC贴壁培养
[0022]用含1%FBS的RPM1-1640培养基调整单个核细胞浓度为4X 106/mL，取5ml加到T25培养瓶中，放置在37°C、5%C02孵箱中；2h后取出，镜下观察有细胞贴壁，吸去悬浮的细胞，并用培养基轻轻冲洗瓶底，将洗液与悬浮细胞离心后用于培养CIK;贴壁的细胞加入含GM-CSF (50ng/mL)、IL-4 (50ng/mL)、双抗(100U/mL)和 10%FBS 的 RPM1-1640 培养基 6mL开始培养；3 天后补加含 GM-CSF (50ng/mL)、IL-4 (50ng/mL)、双抗(100U/mL)和 10%FBS的RPM1-1640培养基3ml继续培养；第6天，将细胞混匀，取出一部分做FACS (HLA_DR\CDla\CD86)，其余换用配制好的培养基培养(1%FBS、GM-CSF1000UI/ml、IL_4500UI/ml、IL-61000UI/ml、IL-1 β 1900UI/ml、TNF-a llOOUI/ml),在这里进行单表位多聚抗原肽(SEA-MVP)负载，添加量为1.5，并孵育过夜；第7天，进行常规检测后制备DC疫苗注射液。
[0023](三)DC疫苗制备
[0024]将促熟后的DC细胞进行离心清洗，400g、IOmin ;吸去上清，用复方电解质注射液重悬细胞沉淀；离心400g、10min ;反复清洗3遍；将清洗后的DC细胞用10%的人血白蛋白的复方电解质注射液垂悬；混匀后进行装袋封口，并抽取部分样品进行检测；检测合格后的注射液须在4°C保存，并在24h之内应用。
[0025]实施例2促成熟后DC细胞的免疫表型检测
[0026]取促成熟后DC细胞(第6天，将细胞混匀后取样)，用无钙镁PBS洗2次后，各取I X 105/mL,分别加入相应的FCM管中。加入待检测单克隆抗体包括⑶11C、HLA_DR、⑶83和⑶86抗体各5μ 1，4°C避光孵育30分钟，每10分钟摇晃I次，使细胞与抗体充分接触。用PBS洗2次，并重悬在400 μ I的PBS中，采用流式细胞仪FASCSCalibur (BD Biosciences)检测，结果见表1、图2-4。[0027]表1
【权利要求】
1.树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)从脐血中分离得到脐血单核细胞； (2)用含1%FBS 的RPM1-1640培养基贴壁培养脐血单核细胞，去除未贴壁细胞，向贴壁细胞中加入含有GM-CSF、IL-4、双抗和10%FBS的RPM1-1640培养基，继续培养；三天后补加半量的所述RPM1-1640培养基； (3)第6 天，将细胞混匀，换用含有 1%FBS、GM-CSF, IL_4、IL_6、IL-1 β 和 TNF-α (肿瘤坏死因子_α )的培养基，同时进行单表位多聚抗原肽(SEA-MVP)负载，并孵育过夜； (4)第7天，进行常规检测后制备DC疫苗注射液。
2.如权利要求1所述的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，加入的 GM-CSF 浓度为 500-1500UI/ml，IL-4 浓度为 200_1000UI/ml，IL-6 浓度为 500-1500UI/ml ο
3.如权利要求1所述的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，培养基中 GM-CSF 浓度为 20-100ng/mL，IL-3 浓度为 50_150ng/mL，双抗浓度为 50_150U/mL，IL-1 β 浓度为 1000-3000UI/ml、TNF-a 浓度为 500UI_1500UI/ml。
4.如权利要求1-3任一项所述的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述所述单表位多聚抗原肽的加入量为0.5-10mg/ml。
5.如权利要求1-3任一项所述的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，具体的，步骤(4)包括如下步骤:将促熟后的DC细胞进行离心清洗后吸去上清，用复方电解质注射液重悬细胞沉淀；将细胞沉淀离心后反复清洗3遍；将清洗后的DC细胞用10%的人血白蛋白的复方电解质注射液垂悬，混匀后进行装袋封口。
【文档编号】A61P35/00GK103948917SQ201410131192
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】刘乐锋 申请人:江苏和泽生物科技有限公司