树突状细胞及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供了树突状细胞及其制备方法和用途。具体的，本发明提出了树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤性细胞的组合在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者抑制肝癌，其中，所述树突状细胞特异性识别肝癌病灶。根据本发明的实施例，树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤性细胞的组合能够有效治疗或者抑制肝癌。
【专利说明】树突状细胞及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体的，本发明涉及树突状细胞及其制备方法和用途，更具体的，本发明涉及树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤性细胞的组合在制备药物中的用途、制备树突状细胞的方法、药物以及树突状细胞。
【背景技术】
[0002]肝癌是中国第二位肿瘤杀手，每年死亡人数30多万，占全世界肝癌死亡总数的55%。目前治疗肝癌的主要手段为手术切除、肝移植、局部消融治疗、肝动脉介入治疗、放射治疗、化学治疗和其他治疗。
[0003]在世界任何地区都同样发现，任何原因导致的慢性肝病都可能在肝癌发生和发展过程中起着重要的作用。流行病学和实验研究均表明病毒性肝炎与原发性肝癌的发生有着特定的关系，目前比较明确的与肝癌有关系的病毒性肝炎有乙型、丙型和丁型3种，其中以乙型肝炎与肝癌关系最为密切，主要表现为以下几点:肝细胞癌与HBsAg携带者的发生率相平行。
[0004]然而，现有肝癌的治疗手段仍有待改进。
【发明内容】
[0005]本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有能够有效治疗肝癌的手段。
[0006]在本发明的第一方面，本发明提出了一种树突状细胞(dendritic cell，DC)和细胞因子诱导的杀伤性细胞(cytokine-1nduced killer, CIK)的组合在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者抑制肝癌，其中，所述树突状细胞特异性识别肝癌病灶。
[0007]树突状细胞是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，成熟的树突状细胞能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，并能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的重要环节。
[0008]细胞因子诱导的杀伤性细胞是将人的外周血PBMC (Peripheral BloodMonoclonal Cells)在体外经过多种细胞因子共同培养一段时间后获得的T淋巴细胞，由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞(自然杀伤细胞)样T淋巴细胞。细胞因子诱导的杀伤性细胞增殖能力强，在体外培养两周左右可以使主要效应细胞(CD3+、CD56+)增值1000倍以上；细胞因子诱导的杀伤性细胞毒作用强，远优于传统的LAK细胞和细胞因子Y干扰素、白细胞介素2 ;细胞因子诱导的杀伤性细胞具有广泛的杀瘤作用，在不伤害正常细胞的条件下通过多种途径靶向杀死肿瘤细胞；细胞因子诱导的杀伤性细胞还具有免疫调节作用。DC与CIK细胞联合应用将完成识别肿瘤细胞、杀灭肿瘤细胞的全过程。研究表明DC细胞能够使抑制T细胞(CD4+CD25+)的数量减少、活性减弱，所以共同培养DC、CIK细胞与单纯培养CIK细胞相比在细胞增殖能力、效应细胞(⑶3+、⑶8+、CD3+CD56+)数量以及对肿瘤细胞的细胞毒作用等方面显著增强。
[0009]肿瘤的DC-CIK免疫细胞治疗是继手术、放疗、化疗后的第四种抗肿瘤治疗模式，是向肿瘤患者输入自体的、在体外扩增并激活的免疫细胞，直接杀伤肿瘤细胞或激发机体抗肿瘤免疫反应，从而达到治疗肿瘤的目的。对于实体瘤手术后病人，该治疗可清除体内残余肿瘤细胞、明显降低肿瘤手术后的转移和复发几率；对于放化疗病人，该治疗可清除残存肿瘤细胞、增强放化疗的敏感性、减轻放化疗的毒副作用；对于无法手术及放化疗的中晚期肿瘤患者，该治疗可以抑制肿瘤的增长、增强免疫力、改善生活质量、延长生命周期。肿瘤免疫细胞治疗在全球的累计治疗病例超过数万例，疗效和安全性都比较令人满意。
[0010]因此，树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤性细胞免疫疗法即DC-CIK免疫疗法引入到抗肝癌的治疗中，改善现有技术中抗肝癌免疫效应细胞的杀伤作用，通过细胞因子的添加，寻找新的树突状细胞和细胞因子联合培养诱导的杀伤性细胞培养方法，在生物【技术领域】意义重大。
[0011]根据本发明的实施例，所述树突状细胞可以是通过下列步骤获得的:(I)获取外周血，所述外周血来自于携带所述病灶的个体；(2)从所述外周血中分离单个核细胞；(3)刺激所述单个核细胞向树突状细胞分化，以便获得所述树突状细胞，其中，在步骤(3)中包括将所述单个核细胞与所述病灶的特异性抗原接触，所述特异性抗原为甲胎蛋白和乙肝疫苗的至少之一。
[0012]根据本发明的实施例，所述个体进一步患有慢性乙肝。发明人惊奇地发现，本发明的树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤性细胞的组合能够有效的治疗慢性乙肝性肝癌。
[0013]根据本发明的实施例，步骤(3)进一步包括:(3-1)利用巨噬细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素4刺激所述单个核细胞向树突状细胞分化；(3-2)将步骤(3-1)中所得到的细胞与甲胎蛋白和乙肝疫苗接触，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的重量浓度比例为1:1 ;以及(3-3)将步骤(3-2)中所得到的细胞与IL-β、IL-6和TNF-α的至少之一接触，以便获得所述树突状细胞。
[0014]原发性肝癌患者血清中甲胎蛋白(a-fetoprotein)AFP升高可达250ug?6mg/ml,(甚至达到9mg/ml)，相当于正常人的数十倍乃至数万倍，因此血清AFP的测定是目前诊断原发性肝癌最常用、较敏感、特异性较强的早期诊断方法，现已广泛用于肝癌的普查、诊断、判断治疗效果、预测复发中。AFP与肿瘤大小有一定的相关性，即肿瘤越小，阳性率越低，AFP也与病理类型相关，癌细胞分化I级和II级，AFP相对较低，III级时相对较高。近年来采用AFP异质体和AFP同时测定，可使肝癌诊断阳性率提高至92%，假阳性低于15%。
[0015]发明人惊奇地发现，通过采用AFP (甲胎蛋白)进行刺激而得到树突状细胞能够显著提高所得到的树突状细胞对肝癌病灶的特异性识别。
[0016]根据本发明的实施例，所述巨噬细胞集落刺激因子的浓度为1000U/mL，所述重组人白细胞介素4的浓度为500U/mL。
[0017]根据本发明的实施例，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的浓度分别独立地为40?
60微克/毫升,最优选50微克/毫升。
[0018]根据本发明的实施例，所述树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤性细胞的组合是通过将所述树突状细胞和所述细胞因子诱导的杀伤性细胞进行共培养获得的，其中，在所述共培养时，所述树突状细胞与所述细胞因子诱导的杀伤性细胞的接种比例为1:8?12，优选 1:10。
[0019]根据本发明的实施例，所述细胞因子诱导的杀伤性细胞是通过下列步骤获得的:(4-1)利用IFN-Y刺激步骤(2)中所获得的单个核细胞24小时，其中，所述IFN-Y的浓度为1000U/ml ;以及(4-2)将步骤(4_1)中所得到的细胞与CD3单克隆抗体和重组人白细胞介素2接触，以便获得所述细胞因子诱导的杀伤性细胞，其中，所述CD3单克隆抗体的浓度为50ng/ml，重组人白细胞介素2的浓度500U/ml。
[0020]在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备树突状细胞的方法，其中，所述树突状细胞特异性识别肝癌病灶。根据本发明的实施例，所述方法包括:(I)获取外周血，所述外周血来自于携带所述病灶的个体；(2)从所述外周血中分离单个核细胞；(3)刺激所述单个核细胞向树突状细胞方向分化，以便获得所述树突状细胞，其中，在步骤(3)中包括将所述单个核细胞与所述病灶的特异性抗原接触，所述特异性抗原为甲胎蛋白和乙肝疫苗的至少之一。
[0021]根据本发明的实施例，步骤(3)可以进一步包括:(3-1)利用巨噬细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素4刺激所述单个核细胞向树突状细胞分化；(3-2)将步骤(3-1)中所得到的细胞与甲胎蛋白和乙肝疫苗接触，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的重量浓度比例为1:1 ;以及(3-3)将步骤(3-2)中所得到的细胞与IL-β、IL-6和TNF-α的至少之一接触，以便获得所述树突状细胞。
[0022]根据本发明的实施例，所述巨噬细胞集落刺激因子的浓度为1000U/mL，所述重组人白细胞介素4的浓度为500U/mL。
[0023]根据本发明的实施例，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的浓度分别独立地为40?
60微克/毫升,最优选50微克/毫升。
[0024]在本发明的第三方面，本发明提出了一种药物，所述药物用于治疗或者预防肝癌。根据本发明的实施例，所述药物包括:树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤性细胞的组合，其中，所述树突状细胞特异性识别肝癌病灶。
[0025]根据本发明的实施例，所述树突状细胞是通过前面所述的方法制备的。
[0026]在本发明的第四方面，本发明提出了一种树突状细胞，所述树突状细胞特异性识别肝癌病灶。
[0027]根据本发明的实施例，所述树突状细胞是通过前面所述的方法制备的。
[0028]具体地，根据本发明的实施例，本发明提供了一种用于抗肝癌的树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤性细胞培养方法，其包括下列步骤:
[0029]步骤a:自体血浆的制备
[0030]在生物安全柜中将注射器中的40ml-60ml抗凝全血平均分装到2支50mL无菌离心管中，用离心机离心，离心转速为2500rpm，离心lOmin，离心完成后吸取上层血浆，56°C，30min灭活补体，置于4°C水浴中放置15分钟，再用离心机离心，离心速度为2500rpm，离心20分钟，转移上清液至新的离心管。标记，置于_20°C冰箱中保存；
[0031]步骤b:单个核细胞的分离
[0032]向步骤a中所述的离心后未被吸取的血细胞中加入缓冲盐溶液25mL，稀释血细胞，边吹打边旋转离心管，混匀。取30ml混匀的稀释血缓慢加到装有淋巴细胞分离液的50mL离心管内。用离心机离心，离心转速为210rpm离心30分钟；吸出白膜层至装有30ml缓冲盐溶液的离心管中，用离心机离心，离心速度为2100rpm，离心15分钟；
[0033]步骤C:离心洗涤、计数
[0034]将上述步骤b中得到的细胞悬液，弃上清，每管加5mL缓冲盐溶液，重悬细胞沉淀，并转移至一管，再吸取适量缓冲盐溶液漂洗各管后收集残留细胞，定容至30mL，留样计数。用离心机离心，离心转速1500rpm,离心10分钟；
[0035]步骤d:重悬细胞、接种
[0036]将上述步骤c中得到的细胞悬液，弃上清，取5mL培养液重悬细胞沉淀，移入表面积为75平方厘米的培养瓶中，每瓶l*106/mL的密度，置于37°C、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中，孵育2小时；
[0037]步骤e:DC细胞的培养及鉴定
[0038]从上述步骤d所述的培养瓶中吸出悬浮细胞备用，加入rhGM-CSF1000U/ml、rhIL-4 500U/ml，刺激细胞向DC细胞分化，扩瓶；在培养的第5天加入甲胎蛋白及乙肝疫苗50 μ g/ml ;在培养的第6天加入IL- β、IL-6,TNF α细胞因子；第7天收获DC细胞，台盼蓝染色检测细胞活力，流式细胞仪检测DC细胞CDla、CDllc和CD83免疫表型标记；
[0039]步骤f:CIK细胞的培养与鉴定
[0040]将步骤e中的所述的悬浮细胞重新接种于培养瓶中，加入IFN- Y 1000U/ml ;24h后加入⑶350ng/ml单克隆抗体和rhIL_2500U/ml ;培养；第7天取样，台盼蓝染色检测细胞活力，流式细胞仪检测CIK细胞⑶3+⑶56+免疫表型标记。
[0041 ] 步骤g: DC-CIK细胞联合培养
[0042]将收集的DC细胞加入CIK细胞联合培养，最后一次补加培养基后取样进行细菌、真菌、内毒素检测、确认检测结果阴性后第4天收获细胞，台盼蓝染色检测细胞活力，流式细胞仪检测CIK细胞⑶3+⑶56+免疫表型标记；
[0043]步骤h:细胞收获
[0044]将细胞培养袋中的细胞悬液混匀后分装到50ml离心管中，45ml/管，配平。用离心机离心，离心转速为1500rpm, 1min0弃上清,每管加5ml含有稀释血衆的生理盐水,吹打均匀，每8管合I管，再用少量生理盐水漂洗各离心管收集残留细胞，配平。用离心机离心,离心转速为1500rpm, lOmin。弃上清,加生理盐水重悬,合为I管,配平。用离心机离心，离心转速为1500rpm, lOmin。弃上清,轻弹离心管底,用移液管加1mL细胞重悬液,轻轻吹打，重悬细胞，先吸上清沿管壁流下至沉淀散开再吹打，再加1mL细胞重悬液和5mL白蛋白混匀。准备生理盐水袋放入超净台，酒精纱布擦拭管口处，打开管口塑料盖露出软塞，打开50ml注射器包装，倾斜离心管将注射器伸入吸出细胞悬液。更换注射器的针头为9号针头，盐水袋向上，将细胞悬液注入，注射完后抽出气体，装入包装袋，传递窗传出。
[0045]另外，根据本发明上述实施例的细胞培养基还可以具有如下附加的技术特征:所述步骤b中所述的缓冲盐溶液为PBS溶液。
[0046]根据本发明的实施例，所述步骤a中所述的淋巴细胞分离液为ficoll分离液。
[0047]根据本发明的实施例，所述步骤b中的白膜层为离心完成后分为3层的中间层。
[0048]根据本发明的实施例，所述步骤d中的培养液为GT-T551培养液。
[0049]根据本发明的实施例，所述步骤e中所述的扩瓶是指在培养的第3天I瓶扩3瓶，第6天3瓶扩9瓶。
[0050]根据本发明的实施例，所述步骤f中所述的培养为扩瓶培养。
[0051]根据本发明的实施例，所述步骤f中所述的培养为培养袋中培养。
[0052]根据本发明的实施例，所述步骤g中所述的DC细胞和CIK细胞联合的比例为1:10。
[0053]根据本发明的实施例，所述步骤h中所述的稀释血浆的含量为4%。
【具体实施方式】
[0054]下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0055]实施例1
[0056]肝内胆管细胞癌术后患者自体血DC-CIK免疫细胞治疗，具体内容如下:
[0057]1、临床资料
[0058]病例1，女，69岁，肝内胆管细胞癌，为手术后病理检查确诊病例。
[0059]2、主要材料
[0060](a)耗材:淋巴细胞分离液(GE healthcare)，GT-T551培养基(购自宝日医生物技术有限公司)，rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-2、IL-β、IL-6, IFN-Y、TNF α、甲胎蛋白、乙肝疫苗、⑶3单克隆抗体(北京远策药业责任有限公司)，50ml离心管、1ml离心管、5ml移液管、25ml移液管、巴氏小管、细胞培养瓶、细胞培养袋(Thermo)，庆大霉素(购自宜昌人福药业责任有限公司)。
[0061](b)仪器:流式细胞仪(beckman)、生物安全柜(力康)、细胞培养箱(力康)、高速离心机(久保田)、倒置显微镜(江南)、超低温冰箱(海尔)、液氮储存罐(Thermo)。
[0062]具体步骤:
[0063](I)用含有抗凝剂的注射器抽取肝癌患者外周血45mL ；
[0064](2)在生物安全柜中将50mL抗凝全血平分到两支50mL的无菌离心管中，2500rpm离心1min ；
[0065](3)离心完成后将上层血浆(每管约1mL)转移至新的离心管中，56°C，30min灭活补体，4°C水浴15min，2500rpm*20min离心去除纤维蛋白，将上清转移至新的离心管，置于-20°C冰箱备用；
[0066](4)向剩余的血细胞中加入PBS每管25mL，边吹打边旋转离心管至混匀重点吹打管壁和管底，留ImL稀释血做乙肝五项、梅毒、艾滋、丙肝检测。
[0067](5)将混勻的稀释血每30ml缓慢加到装有15mLficoll的50ml离心管内。2100rpm离心30min,慢升慢降；
[0068](6)离心完成后分为3层，用巴氏吸管小心吸取中间的白膜层转至装有30mlPBS的离心管中，每管42.5mL,配平离心2100rpm, 1min ；
[0069](7)弃上清，每管加5mL的PBS重悬细胞，轻柔吹打合为一管，再用5mL的PBS漂洗各管定容至30ml,留样计数,抒紧盖子离心2100rpm, 1min ；
[0070](8)弃上清，用GT-T551重悬细胞，步骤(7)中细胞计数为7.3*107,按每瓶1*106/ml的密度接种于75cm2的培养瓶中，种2瓶，置于温度为37°C、CO2%饱和湿度的细胞培养箱中孵育2h(记为第O天)。
[0071](9)吸出非贴壁细胞备用，向贴壁细胞中加入rhGM-CSF 1000U/ml (浓度均为终浓度)、rhIL-4500U/ml，刺激细胞向DC细胞分化，培养的第3天细胞贴壁率约为85%，培养液颜色变为橘黄，I瓶扩3瓶；第6天细胞贴壁率约为80%，培养液颜色变为橘黄I瓶再扩3瓶；在培养的第5天加入乙肝疫苗50 μ g/ml，按照1:1的浓度加入甲胎蛋白，刺激抗原特异性细胞的产生；在培养的第6天加入IL-β、IL-6、TNFa细胞因子，每种细胞因子的终浓度为10-100ng/ml，刺激DC细胞成熟；第7天收获DC细胞；取样，台盼蓝染色检测细胞活力，流式细胞仪检测DC细胞⑶la、⑶I Ic和⑶83免疫表型标记；
[0072](10)将步骤(9)中的悬浮细胞重新接种于培养瓶中，加入IFN- Y 1000U/ml ；
[0073]a、I天后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和rhIL_2500U/ml刺激CIK细胞的生长和增殖；
[0074]b、第4天镜下观察细胞数量多、结团较大、培养基颜色变为橘黄色，将细胞转移到培养袋中，体积扩增到200ml ；
[0075]C、第5天镜下观察细胞体积增大、胞浆少、核大，结团多，培养基变为橘黄色补液至 600ml ；
[0076]d、第6天镜下观察细胞生长状态良好，培养基颜色金黄补液至1200ml，混匀，取样涂板做细菌、真菌检测；
[0077](11)将DC细胞按1:10的比例加入CIK细胞培养袋中混匀，继续培养；
[0078](12)第9天扩袋。将1200ml培养液分装至两个培养袋中，其中将600ml的培养液分装至a袋中，并利用补充培养基至1200ml，将另外600ml的培养液分装至b袋中，并利用补充培养基至1500ml，两袋都要取样质检；
[0079](13)第12天收获a袋细胞
[0080]a、分装:将细胞培养袋中的细胞悬液混匀后分装到支50ml离心管中，45ml/管，共27管，配平。留5ml细胞悬液样品做内毒素和革兰氏染色检测及计数；
[0081]b、离心收集细胞:1500rpm*10min ;
[0082]C、第一次离心洗涤:弃上清，每管加5ml生理盐水(含有4 %的稀释血浆)，吹打均匀，每8管合I管，共4管，再用少量生理盐水漂洗各离心管收集残留细胞，配平，lSOOrpm^lOmin ；
[0083]d、第二次离心洗涤:弃上清，加生理盐水重悬，合为I管，配平。用离心机离心，离心转速为1500rpm,离心1min ；
[0084]e、重悬细胞:弃上清，先轻弹离心管底，使细胞沉淀松散。再用1ml移液管加1ml细胞重悬液，轻轻吹打，重悬细胞，开始不要直接吸出沉淀，要先吸上清沿管壁流下至沉淀散开再吹打(检查是否有颗粒沉淀，如果吹不散要使用70um过滤器过滤细胞沉淀)再加5mll0细胞重悬液和5ml白蛋白混匀。
[0085]f、将细胞悬液注入将生理盐水袋:准备生理盐水袋放入超净台，酒精纱布擦拭管口处，打开管口塑料盖露出软塞，打开50ml注射器包装，不要碰到注射器刻度线以下的管体，倾斜离心管将注射器伸入吸出细胞悬液，保证无菌操作。更换注射器的针头为9号针头，盐水袋向上，将细胞悬液注入，同时观察是否有沉淀，注射完后抽出相应体积的气体。
[0086]g、检查确认:再次检查是否有沉淀，检查注射针孔处是否有液体渗出确定无误后装入包装袋，传递窗传出。
[0087](14)第13天收获b袋细胞，方法同步骤(13)
[0088](15) a、b 细胞计数分别为 3.54*109、4.57*109 ；
[0089]实施例2:
[0090]原发性肝癌II期患者自体血DC-CIK免疫细胞治疗，具体内容如下:
[0091]1、临床资料
[0092]病例2，男，66岁，原发性肝癌II期，为手术后病理检查确诊病例。
[0093]2、主要材料
[0094](a)耗材:淋巴细胞分离液(GE healthcare)，GT-T551培养基(来源于宝日医生物技术有限公司)，rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-2、IL- β、IL-6, IFN- Y、TNF α、乙肝疫苗、CD3单克隆抗体(北京远策药业责任有限公司)，50ml离心管、1ml离心管、5ml移液管、25ml移液管、巴氏小管、细胞培养瓶、细胞培养袋(Thermo fisher)，庆大霉素(来源于宜昌人福药业责任有限公司)。
[0095](b)流式细胞仪(bekman)、生物安全柜(力康)、细胞培养箱(力康)、高速离心机(久保田)、倒置显微镜(江南)、超低温冰箱(海尔)、液氮储存罐(Thermo)。
[0096](I)用含有抗凝剂的注射器抽取肝癌患者外周血55ml ；
[0097](2)在生物安全柜中将50ml抗凝全血平分到两支50ml的无菌离心管中，2500rpm离心1min ；
[0098](3)离心完成后将上层血浆(每管约12.5ml)转移至新的离心管中，56°C，30min灭活补体，4°C水浴15min，2500rpm*20min离心去除纤维蛋白，将上清转移至新的离心管，置于-20°C冰箱备用；
[0099](4)向剩余的血细胞中加入PBS每管25ml，边吹打边旋转离心管至混匀重点吹打管壁和管底，留Iml稀释血做乙肝五项、梅毒、艾滋、丙肝检测。
[0100](5)将混勻的稀释血每30ml缓慢加到装有15ml ficoll的50ml离心管内。2100rpm离心30min,慢升慢降；
[0101](6)离心完成后分为3层，用巴氏吸管小心吸取中间的白膜层转至装有30mlPBS的离心管中，每管42.5ml,配平离心2100rpm, 1min ；
[0102](7)弃上清，每管加5mlPBS重悬细胞，轻柔吹打合为一管，再用5mlPBS漂洗各管定容至30ml,留样计数,抒紧盖子离心2100rpm, 1min ；
[0103](8)弃上清，用GT-T551重悬细胞，步骤(7)中细胞计数为8.1*107按按照每瓶l*106/ml的密度接种于75cm2的培养瓶中，种2瓶，置于细胞培养箱中，37°C、C02%孵育2h(记为第O天)。
[0104](9)吸出非贴壁细胞备用，加入rhGM-CSF 1000U/ml (浓度均为终浓度)、rhIL-4500U/ml，刺激细胞向DC细胞分化，在培养的第3天细胞贴壁率约为75%，培养液颜色变为橘黄，I瓶扩3瓶；;在培养的第5天加入乙肝疫苗50 μ g/ml，刺激抗原特异性细胞的产生；在培养第6天细胞贴壁率约为80 %，培养液颜色变为橘黄I瓶再扩3瓶，加入IL- β、IL-6,TNFa细胞因子，每种细胞因子的终浓度为10_100ng/ml，刺激DC细胞成熟；第7天收获DC细胞；取样，台盼蓝染色检测细胞活力，流式细胞仪检测DC细胞CDla、CDllc和CD83免疫表型标记；
[0105](10)将步骤(9)中的悬浮细胞重新接种于培养瓶中，加入IFN- Y 1000U/ml ；
[0106]a、I天后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和rhIL_2500U/ml刺激CIK细胞的生长和增殖
[0107]b、第4天镜下观察细胞数量多，结团较大、多、培养基颜色变为金黄色，将细胞转移到培养袋中，体积扩增到300ml ；
[0108]C、第5天镜下观察细胞体积增大、胞浆少、核大，结团多，培养基变为橘黄色补液至 600ml ；
[0109]d、第6天镜下观察细胞生长状态良好，培养基颜色金黄补液至1200ml，混匀，取样涂板做细菌、真菌检测；
[0110]e、第7天收获CIK细胞；台盼蓝染色检测细胞活力，流式细胞仪检测CIK细胞⑶3+CD56+免疫表型标记；
[0111](11)将DC细胞按1:10的比例加入CIK细胞培养袋中混匀，继续培养；
[0112](12)第9天扩袋。将1200ml培养液分装至两个培养袋中，其中将600ml的培养液分装至a袋中，并利用补充培养基至1200ml，将另外600ml的培养液分装至b袋中，并利用补充培养基至1500ml，两袋都要取样质检；
[0113](13)第12天收获a袋细胞。
[0114]a、分装:将细胞培养袋中的细胞悬液混匀后分装到支50ml离心管中，45ml/管，共27管，配平。留5ml细胞悬液样品做内毒素和革兰氏染色检测及计数；
[0115]b、离心收集细胞:1500rpm*10min ;
[0116]C、第一次离心洗涤:弃上清，每管加5ml生理盐水(含有4%的稀释血浆)，吹打均匀，每8管合I管，共4管，再用少量生理盐水漂洗各离心管收集残留细胞，配平，1500rpm*10min ；
[0117]d、第二次离心洗涤:弃上清，加生理盐水重悬，合为I管，配平。1500rpm*10min ；
[0118]e、重悬细胞:弃上清，先轻弹离心管底，使细胞沉淀松散。再用1ml移液管加1ml细胞重悬液，轻轻吹打，重悬细胞，开始不要直接吸出沉淀，要先吸上清沿管壁流下至沉淀散开再吹打(检查是否有颗粒沉淀，如果吹不散要使用70um过滤器过滤细胞沉淀)再加5mll0细胞重悬液和5ml白蛋白混匀。
[0119]f、将细胞悬液注入将生理盐水袋:准备生理盐水袋放入超净台，酒精纱布擦拭管口处，打开管口塑料盖露出软塞，打开50ml注射器包装，不要碰到注射器刻度线以下的管体，倾斜离心管将注射器伸入吸出细胞悬液，保证无菌操作。更换注射器的针头为9号针头，盐水袋向上，将细胞悬液注入，同时观察是否有沉淀，注射完后抽出相应体积的气体。
[0120]g、检查确认:再次检查是否有沉淀，检查注射针孔处是否有液体渗出确定无误后装入包装袋，传递窗传出。
[0121](14)第13天收获b袋细胞，方法同步骤(13)。
[0122](15)细胞计数分别为 3.7*109、4.72*109。
[0123]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0124]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【权利要求】
1.树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤性细胞的组合在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者抑制肝癌，其中，所述树突状细胞特异性识别肝癌病灶， 优选地，所述树突状细胞是通过下列步骤获得的: (1)获取外周血，所述外周血来自于携带所述病灶的个体； (2)从所述外周血中分离单个核细胞； (3)刺激所述单个核细胞向树突状细胞分化，以便获得所述树突状细胞， 其中， 在步骤(3)中包括将所述单个核细胞与所述病灶的特异性抗原接触，所述特异性抗原为甲胎蛋白和乙肝疫苗的至少之一， 任选地，所述个体进一步患有慢性乙肝。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(3)进一步包括: (3-1)利用巨噬细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素4刺激所述单个核细胞向树突状细胞分化； (3-2)将步骤(3-1)中所得到的细胞与甲胎蛋白和乙肝疫苗接触，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的重量浓度比例为1:1 ;以及 (3-3)将步骤(3-2)中所得到的细胞与IL-β、IL-6和TNF-α的至少之一接触，以便获得所述树突状细胞， 优选地，所述巨噬细胞集落刺激因子的浓度为1000U/mL，所述重组人白细胞介素4的浓度为500U/mL， 优选地，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的浓度分别独立地为40?60微克/毫升。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤性细胞的组合是通过将所述树突状细胞和所述细胞因子诱导的杀伤性细胞进行共培养获得的， 其中， 在所述共培养时，所述树突状细胞与所述细胞因子诱导的杀伤性细胞的接种比例为1:8?12，优选1:10。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述细胞因子诱导的杀伤性细胞是通过下列步骤获得的: (4-1)利用IFN-Y刺激步骤(2)中所获得的单个核细胞24小时，其中，所述IFN-Y的浓度为1000U/ml ；以及 (4-2)将步骤(4-1)中所得到的细胞与CD3单克隆抗体和重组人白细胞介素2接触，以便获得所述细胞因子诱导的杀伤性细胞，其中，所述CD3单克隆抗体的浓度为50ng/ml，重组人白细胞介素2的浓度500U/ml。
5.一种制备树突状细胞的方法，其中，所述树突状细胞特异性识别肝癌病灶，所述方法包括: (1)获取外周血，所述外周血来自于携带所述病灶的个体； (2)从所述外周血中分离单个核细胞； (3)刺激所述单个核细胞向树突状细胞方向分化，以便获得所述树突状细胞， 其中， 在步骤(3)中包括将所述单个核细胞与所述病灶的特异性抗原接触，所述特异性抗原为甲胎蛋白和乙肝疫苗的至少之一， 优选地，步骤(3)进一步包括: (3-1)利用巨噬细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素4刺激所述单个核细胞向树突状细胞分化； (3-2)将步骤(3-1)中所得到的细胞与甲胎蛋白和乙肝疫苗接触，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的重量浓度比例为1:1 ;以及 (3-3)将步骤(3-2)中所得到的细胞与IL-β、IL-6和TNF-α的至少之一接触，以便获得成熟的树突状细胞， 优选地，所述巨噬细胞集落刺激因子的浓度为1000U/mL，所述重组人白细胞介素4的浓度为500U/mL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述甲胎蛋白和所述乙肝疫苗的浓度分别独立地为40?60微克/晕升。
7.—种药物，所述药物用于治疗或者预防肝癌，其特征在于，所述药物包括: 树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤性细胞的组合， 其中，所述树突状细胞特异性识别肝癌病灶。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述树突状细胞是通过权利要求5或6所述的方法制备的。
9.一种树突状细胞,所述树突状细胞特异性识别肝癌病灶。
10.根据权利要求9所述的树突状细胞，其特征在于，所述树突状细胞是通过权利要求5或6所述的方法制备的。
【文档编号】A61P35/00GK104288179SQ201410356051
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】姚惟琦, 武栋成 申请人:武汉汉密顿生物科技股份有限公司