一种制备可降解载药涂层支架的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备可降解载药涂层支架的方法，具体方法为：第一步、预处理；第二步、将第一步中制备的冻干物溶于三羟甲基氨基甲烷缓冲液中；第三步、钢片的包被；第四步、包被金黄色葡萄球菌A蛋白；第五步、进行封闭，本发明的有益效果：本发明提供的可降解载药涂层支架制备方法解决了目前应用的药物涂层支架中存在的诸多问题，采用本发明提供的制备方法所制取的药物涂层耐冲刷、涂层均匀、稳定、体外捕获内皮组细胞能力强，可以达到很好的抑制血栓形成及降低再狭窄的目的，具有重要的临床应用价值。
【专利说明】一种制备可降解载药涂层支架的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备支架的方法，特别涉及一种制备可降解载药涂层支架的方 法。
【背景技术】
[0002] 目前，心血管病已经成为威胁人类生命的最主要疾病之一。世界卫生组织指出，全 球每年有约1700万人死于心血管疾病，占全球死亡人数的三分之一，预计到2020年，这个 数字将有可能突破2000万。心血管疾病死亡病例中有80%分布在低中等收入国家。一项 关于我国人口死亡原因的调查分析资料显示，近年国人死亡人员中，心脑血管疾病导致死 亡的占40%，而且这个比例在呈年轻化、上升的趋势。在心血管疾病中对人类最大的病种就 是心肌梗塞，已成为我国人口的第一死因，成为危害国人健康的第一杀手，给社会和家庭造 成巨大负担。
[0003] 自1985年Palmaz等首次在外周动脉血管中使用气囊支架后，支架置入术成为治 疗心血管病的重要途径之一。然而支架置入术后内膜的过度增生会导致再狭窄的发生，单 纯裸支架再狭窄的发生率可达10-30%，故支架置入术后再狭窄一直是心血管病治疗研究 中重中之重。
[0004] 为了防止内皮过渡增生降低支架内再狭窄发生率，人们发明了药物涂层支架 (Drug-Eluting Stent,DES)。涂层材料经过选择，具有良好的生物相容性，并且含有抗增生 的药物，防止平滑肌细胞过度增生。国际上通常采用的抑制血管平滑肌细胞增生，降低再狭 窄的药物是雷帕霉素和紫杉醇，但由于这些药物与支架材料表面键合弱，涂层很容易被血 流快速剥离，随着血液的冲刷，药物在1-2周内就降低到很低的浓度，1月后基本上没有药 物作用，难以达到长期抑制平滑肌细胞增生，避免血管内膜过渡增厚导致的血管再狭窄。
[0005] 综合来看，目前应用的药物涂层支架的不足主要包括：
[0006] 1)内皮完整是预防血栓的最重要的屏障。DES的涂层药物在抑制平滑肌细胞过度 增生的同时，也抑制正常内皮细胞再生，导致支架植入后血管内皮化过程延迟，增加了迟发 性血栓形成风险；
[0007] 2)目前支架涂层药物多使用单一药物，而再狭窄是由多种发病机制参与作用， 支架上所涂药物不可能在各个环节发挥作用，从而限制其抗支架内再狭窄（Instent Restenosis，ISR)的作用；
[0008] 3)由于目前常用DES的载体不能降解，在某种程度上也可能会增加病变血管局部 慢性炎症的发生，另外药物发挥作用的时间越长，对组织的渗透作用越长，也是造成内皮化 延迟的可能因素之一
[0009] 4)DES的涂层与支架材料表面键合弱，涂层很容易被血流快速剥离，难以达到长期 抑制平滑肌细胞增生，避免血管内膜过渡增厚导致的血管再狭窄。
[0010] 综上所述，临床上亟待开发一种新的制备方法用以制备出新型的能降低血栓形 成、防止再狭窄、可降解、耐冲刷涂层支架以解决目前治疗面临的困难。
【发明内容】
toon] 本发明的目的是为了解决现有的临床所用血管支架不能有效地降低血栓形成、不 能有效地防止血管再狭窄的发生等诸多问题而提供的一种制备可降解载药涂层支架的方 法。
[0012] 本发明提供的制备可降解载药涂层支架的方法，其具体方法如下所述：
[0013] 第一步、预处理：先用抛光机将钢片抛光至镜面，然后将抛光后的钢片用去污粉清 洗，之后分别用丙酮、乙醇超声清洗，最后用去离子水超声清洗；然后制备多巴胺和肝素缩 合形成的化合物的冻干物；钢片及冻干物紫外线灭菌；三羟甲基氨基甲烷缓冲液的配置： Tris碱0. 121加80ml Milli-Q水溶解，用1M盐酸调节PH值为8. 5,定容至100ml，验证PH 值，灭菌，肝素钠溶液配置：3mg/ml肝素钠的Milli-Q水溶液100ml，用0. 1M NaOH及1%醋 酸调节pH值为4. 2,配好的肝素钠溶液，灭菌；
[0014] 第二步、将第一步中制备的冻干物溶于三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，配好的溶液 中保证多巴胺浓度为4mg/ml ;取48孔板，每孔中放置配置好的溶液，用镊子每孔放1枚钢 片，结束钢片上多巴胺的聚合反应：将钢片自溶液中取出，置于新的48孔板中，Milli-Q水 清洗，清洗后氮气吹干；
[0015] 第三步、钢片的包被：将第二步中制得的钢片进行血管内皮生长因子和肝素的包 被，包被层数为1-10层；具体包被过程为：将血管内皮生长因子溶于pH值为7. 4的PBS缓 冲液中，配置成l〇〇ug/ml溶液，将制得的钢片浸入血管内皮生长因子溶液中，4°C条件下反 应，12小时后取出钢片，去离子水冲洗，氮气吹干，制得的钢片表面生成有血管内皮生长因 子层，血管内皮生长因子的等电点为8. 5,通过调节pH值能够使血管内皮生长因子溶液和 肝素钠溶液分别带正电、负电，然后一层肝素一层血管内皮生长因子再一层肝素这样层层 静电吸附直至所需层数；
[0016] 第四步、包被金黄色葡萄球菌A蛋白：将金黄色葡萄球菌A蛋白中加入PBS，配置 成lmg/ml溶液，再进行稀释，最终配置成0. lmg/ml金黄色葡萄球菌A蛋白溶液，将上步中 获得的支架置于金黄色葡萄球菌A蛋白溶液中，4°C冰箱中静置24小时，将钢片取出用pH 值为7. 4的PBS溶液清洗3次，氮气吹干；
[0017] 第五步、进行封闭：将上步中被金黄色葡萄球菌A蛋白包被后的支架浸入10mg/ ml牛血清白蛋白中，4°C下静置封闭，取出用PBS清洗，氮气吹干，然后配置⑶34抗体溶液， 将封闭后的支架浸入CD34抗体溶液中，4°C条件下反应12小时，取出用PBS清洗，常温干 燥；进一步，进行CD34抗体的突光标记和表征：包被抗体CD34的支架中取一枚进行突光标 记，之前用兔血清封闭，异硫氰酸荧光素标记鼠抗兔IgG抗体配置成混合溶液，将包被抗体 ⑶34的支架与标记物37°C条件下共浴1小时，常温下过夜干燥，固定于载玻片上，送检免疫 荧光。
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] 本发明提供的可降解载药涂层支架制备方法解决了目前应用的药物涂层支架中 存在的诸多问题，采用本发明提供的制备方法所制取的药物涂层耐冲刷、涂层均匀、稳定、 体外捕获内皮组细胞能力强，可以达到很好的抑制血栓形成及降低再狭窄的目的，具有重 要的临床应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为涂层支架上的血管内皮生长因子和⑶34抗体含量示意图。
[0021] 图2为酶联免疫吸附法检测涂层支架材料上的血管内皮生长因子的含量示意图。
[0022] 图3为酶联免疫吸附法检测涂层支架材料上的CD34抗体的含量示意图。
[0023] 图4为内皮祖细胞分离培养的细胞状态示意图。
[0024] 图5为流式细胞仪检测的内皮祖细胞空白对照示意图。
[0025] 图6为流式细胞仪检测的内皮祖细胞CD133的阳性率示意图。
[0026] 图7为流式细胞仪检测的内皮祖细胞含激酶插入区受体的阳性率示意图。
[0027] 图8为流式细胞仪检测的内皮祖细胞CD34的阳性率示意图。
[0028] 图9为噻唑蓝法检测内皮祖细胞的增殖示意图。
【具体实施方式】
[0029] 本发明提供的制备可降解载药涂层支架的方法，其具体方法如下所述：
[0030] 第一步、预处理：先用抛光机将钢片抛光至镜面，然后将抛光后的钢片用去污粉清 洗，之后分别用丙酮、乙醇超声清洗，最后用去离子水超声清洗；然后制备多巴胺和肝素缩 合形成的化合物的冻干物；钢片及冻干物紫外线灭菌；三羟甲基氨基甲烷缓冲液的配置： Tris碱0. 121加80ml Milli-Q水溶解，用1M盐酸调节PH值为8. 5,定容至100ml，验证PH 值，灭菌，肝素钠溶液配置：3mg/ml肝素钠的Milli-Q水溶液100ml，用0. 1M NaOH及1%醋 酸调节pH值为4. 2,配好的肝素钠溶液，灭菌；
[0031] 第二步、将第一步中制备的冻干物溶于三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，配好的溶液 中保证多巴胺浓度为4mg/ml ;取48孔板，每孔中放置配置好的溶液，用镊子每孔放1枚钢 片，结束钢片上多巴胺的聚合反应：将钢片自溶液中取出，置于新的48孔板中，Milli-Q水 清洗，清洗后氮气吹干；
[0032] 第三步、钢片的包被：将第二步中制得的钢片进行血管内皮生长因子和肝素的包 被，包被层数为1-10层；具体包被过程为：将血管内皮生长因子溶于pH值为7. 4的PBS缓 冲液中，配置成l〇〇ug/ml溶液，将制得的钢片浸入血管内皮生长因子溶液中，4°C条件下反 应，12小时后取出钢片，去离子水冲洗，氮气吹干，制得的钢片表面生成有血管内皮生长因 子层，血管内皮生长因子的等电点为8. 5,通过调节pH值能够使血管内皮生长因子溶液和 肝素钠溶液分别带正电、负电，然后一层肝素一层血管内皮生长因子再一层肝素这样层层 静电吸附直至所需层数；
[0033] 第四步、包被金黄色葡萄球菌A蛋白：将金黄色葡萄球菌A蛋白中加入PBS，配置 成lmg/ml溶液，再进行稀释，最终配置成0. lmg/ml金黄色葡萄球菌A蛋白溶液，将上步中 获得的支架置于金黄色葡萄球菌A蛋白溶液中，4°C冰箱中静置24小时，将钢片取出用pH 值为7. 4的PBS溶液清洗3次，氮气吹干；
[0034] 第五步、进行封闭：将上步中被金黄色葡萄球菌A蛋白包被后的支架浸入10mg/ ml牛血清白蛋白中，4°C下静置封闭，取出用PBS清洗，氮气吹干，然后配置⑶34抗体溶液， 将封闭后的支架浸入CD34抗体溶液中，4°C条件下反应12小时，取出用PBS清洗，常温干 燥；进一步，进行CD34抗体的突光标记和表征：包被抗体CD34的支架中取一枚进行突光标 记，之前用兔血清封闭，异硫氰酸荧光素标记鼠抗兔IgG抗体配置成混合溶液，将包被抗体 ⑶34的支架与标记物37°C条件下共浴1小时，常温下过夜干燥，固定于载玻片上，送检免疫 荧光。
[0035] 具体做法如下：
[0036] 材料准备：钢板规格-316L不锈钢，直径6mm圆片，厚度1mm，刚好能置于96孔板 中；Tris碱、Milli-Q水、4M盐酸（即盐酸浓度为4mol/L)、去污粉、丙酮、乙醇、去离子水、冻 干物、配置好的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、已处理好的钢片（18片）、灭菌的Milli-Q水、肝 素钠、0.说似0!1、1%醋酸、血管内皮生长因子、？85缓冲液溶液（?!1值为7.4)、金黄色葡萄 球菌A蛋白、牛血清白蛋白、CD34抗体，制备好的冻干物成分为多巴胺中氨基和肝素中 羧基缩合反应后形成的化合物。
[0037] 仪器准备：电子天平、100ml容量瓶1个、量筒100ml 1个、加样枪及枪头、PH计、PH 试纸（碱性）、PH试纸（酸性）、抛光机、超声清洗机、60°C烘箱、紫外灭菌灯、超净工作台、48 孔板、无菌镊子、真空低温无菌保存装置、烧杯（200ml)、烧杯（50ml)、加样枪（5ml、200ul)、 EP管。
[0038] 制作方法如下：
[0039] 溶液配制：配置三羟甲基氨基甲烷缓冲液（10mM，pH8. 5) :Tris碱0. 121g加80ml Milli-Q水溶解，用1M盐酸调节PH为8. 5,定容至100ml，验证PH，灭菌。多巴胺中氨基和 肝素中羧基缩合反应后形成的化合物，将化合物制备成冻干物备用。
[0040] 钢片的抛光：用抛光机抛光至镜面。
[0041] 抛光后的钢片处理：将抛光后的钢片用去污粉清洗，之后分别用丙酮、乙醇超声清 洗，分别超声15min。最后去离子水超声清洗3次，每次15 min。清洗后60°C烘箱中干燥 24h。
[0042] 钢片及冻干物紫外线灭菌。
[0043] 钢片上多巴胺聚合：在超净工作台中操作。将冻干物溶于三羟甲基氨基甲烷缓冲 液中，配好的溶液中保证多巴胺浓度为4mg/ml ;取48孔板，将24个孔每孔中放置0. 25ml配 置好的溶液，用镊子每孔放1枚钢片。（1片钢片约需〇. 25ml溶液，共需聚合3组钢片，每组 6片，共需4. 5ml溶液。制备的冻干物中共含20mg多巴胺，可配置5ml溶液。）
[0044] 结束钢片上多巴胺的聚合反应：将24片钢片自溶液中取出，置于新的48孔板中， Milli-Q水清洗3遍，每遍5min，清洗后氮气吹干。取其中8枚钢片，记作肝素-多巴胺组， 真空低温无菌保存。余16片钢片继续下述自组装过程。
[0045] 进行血管内皮生长因子和肝素的层层自组装：配置3mg/ml肝素钠的Mi 11 i-Q水溶 液l〇〇ml，用0. 1M NaOH及1%醋酸调节pH为4. 2,配好的肝素钠溶液，灭菌。配置lug/ml 的血管内皮生长因子的PBS缓冲液溶液（pH为7. 4) 20ml，灭菌。在48孔板的16个孔中各 置入0. 3ml肝素钠溶液，将上述吸附有血管内皮生长因子的钢板各置入孔中，室温下静置 30min。将钢片取出，置入48孔板新的孔中，之后Milli-Q水冲洗3遍，每次5min，氮气吹 干。在48孔板的16个孔中各置入0. 2ml血管内皮生长因子溶液，将上述D-Η组钢片置于 孔中，浸入血管内皮生长因子溶液中，室温下静置30min。将钢片取出，置入48孔板新的孔 中，之后Mi 11 i-Q水冲洗3遍，每次5min，氮气吹干。取其中8枚再次紫外线灭菌后低温干 燥无菌保存，另8枚钢片进行下一步包被。
[0046] 自组装金黄色葡萄球菌A蛋白和⑶34抗体：将总量lmg金黄色葡萄球菌A蛋白中 加入lmlPBS，配置成lmg/ml溶液，再取出100ul稀释于900ulPBS中，最终配置成0· lmg/ml 金黄色葡萄球菌A蛋白溶液，灭菌。8枚钢片每片需要0.25ml，共需2ml。在48孔板的8个 孔中各置入0. 25ml金黄色葡萄球菌A蛋白溶液，将最终获得的钢片置于孔中，室温下静置 30分钟。将钢片取出，置入48孔板新的孔中，之后Milli-Q水冲洗3遍，每次5分钟，氮气 吹干。配置l〇mg/ml牛血清白蛋白，灭菌。将上述钢片浸入10mg/ml牛血清白蛋白中，4°C 下静置24h封闭，取出用Milli-Q水冲洗清洗5min，氮气吹干。配置2ug/ml⑶34抗体溶液， 每枚钢片约需〇. 2ml抗体溶液，共8枚，约需1. 6ml抗体溶液，需要3. 2ug抗体。将封闭后 的钢片浸入抗体溶液中，4°C条件下反应12h。取出用PBS清洗5min，常温下过夜干燥。
[0047] 进行⑶34抗体的荧光标记和表征：取制好的一枚钢片进行荧光标记。之前用兔血 清封闭，异硫氰酸荧光素标记鼠抗兔IgG抗体配置成混合溶液，将钢片与标记物37°C条件 下共浴lh，常温下过夜干燥。固定于载玻片上，送检免疫荧光。
[0048] 具体检测方法如下：
[0049] 一、免疫荧光检测涂层支架上的血管内皮生长因子和⑶34抗体含量检测：
[0050] (一）主要设备和产地：
[0051] 1)激光共聚焦显微镜Leica公司SP5激光共聚焦显微镜
[0052] 2)微量移液枪德国Eppendorf公司
[0053] 3)细胞培养级别盖玻片美国corning公司
[0054] 4)湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜上海实生公司
[0055] (二）试剂：
[0056] 1 X PBS (Sangon 上海生工）
[0057] 牛血清蛋白（美国BD)
[0058] 洗涤缓冲液（Sangon上海生工）
[0059] 抗体：血管内皮生长因子（abeam ab46154, 1:100)
[0060] 突光二抗（abeam ab99700, 1:400)
[0061] (三）实验方法：
[0062] 1、用PBS清洗钢板。
[0063] 2、用含3%牛血清蛋白的PBS在室温封闭lh。
[0064] 3、洗涤缓冲液室温漂洗三次，每次5 min。
[0065] 4、加入一抗（⑶34组不加一抗，直接孵育二抗）湿盒内4°C孵育过夜（附：抗体稀 释比例，P651:100)。
[0066] 5、用PBS在室温漂洗三次，每次5 min。
[0067] 6、加入荧光二抗1 :400,在室温下避光孵育lh。
[0068] 7、去除二抗。
[0069] 8、用PBS在室温漂洗三次，每次10min。
[0070] 9、在荧光显微镜下观察结果。
[0071] (四）实验结果：
[0072] 实验结果如图1所示，D_H[316不锈钢支架-多巴胺聚合物](图中用I表示）， 其中D-(H-V) 10 [316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-血管内皮生长因子）10]组（图 中用II表示）和D-(H-V) 10-A[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-血管内皮生长因 子）10_蛋白A]组（图中用III表示）中血管内皮生长因子包被很成功，能明显检测出血管 内皮生长因子；D-(H-V) 10-A[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-血管内皮生长因 子）10-蛋白A]组中⑶34抗体包被很成功。
[0073] 二、酶联免疫吸附法检测涂层支架材料上的血管内皮生长因子和CD34抗体的含 量
[0074] ( -）主要设备和产地
[0075] 1、80°C低温冰箱美国Thermo Forma公司；
[0076] 2、台式水平离心机Eppendorf，5810R德国；
[0077] 3、Nanopure超纯水仪日本SANYO公司；
[0078] 4、AA-200 型电子天平美国 Denver Instrumol/Lent 公司；
[0079] 5、90 - 2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂
[0080] 6、低温高速离心机ThermoForma公司
[0081] 7、酶标仪：Biotek 公司，型号：synergy H4 Hybrid Reader
[0082] 8、微量移液枪德国Eppendorf公司
[0083] 9、烧杯、容量瓶：上海实生公司
[0084] (二）试剂和材料
[0085] 1、RIPA(完全裂解液）；Tris-HCl (三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）：50mM，pH7. 4; NP_40(非离子去污剂）：1% ;NaCl: 150mM ;EDTA(乙二胺四乙酸二钠）ImM ;PMSF(蛋白酶抑 制剂）ImM ;Leupeptin (亮抑肽酶）10ug/ml ;Pepstatin (抑肽素）2ug/ml ;
[0086] 2、PI3_Kinase activity ELISA Kit (磷脂酰肌醇3-激酶活动酶联免疫试剂盒）： 美国 echelon 公司 K-1000 ;
[0087] 3、ATP (三磷酸腺苷）美国Sigma公司；
[0088] 4、TBST(洗涤缓冲液）：FW ;Tris-Base(三羟甲基氨基甲烷）20mM121. 14、2.4228g/ L ;NaCl、137 mM、58. 44、8· 0145g/L ;Tween-20(吐温 20)0. 1% (V/V)、lml/L、PH = 7· 6。
[0089] (三）实验方法
[0090] 从_80°C取出处理过的细胞（一个100mm圆盘视野> 5X106细胞），酶管中加60 ul RIPA(细胞裂解液），在 4°C裂解 30min。12000rpm，4°C，离心 10min。
[0091] BCA(牛血清白蛋白）法测定蛋白浓度（测定方法详见"Western Blot (蛋白印迹） BCA(牛血清白蛋白）法测定蛋白含量"部分），用RIPA(细胞裂解液）调整样本蛋白浓度至 5ug/ul。测定蛋白样本浓度与平衡（见表1)。
[0092] 表1.测定蛋白样本浓度与平衡表格
[0093]
【权利要求】
1. 一种制备可降解载药涂层支架的方法，其特征在于：其具体方法如下所述： 第一步、预处理：先用抛光机将钢片抛光至镜面，然后将抛光后的钢片用去污粉清洗， 之后分别用丙酮、乙醇超声清洗，最后用去离子水超声清洗；然后制备多巴胺和肝素缩合形 成的化合物的冻干物；钢片及冻干物紫外线灭菌；三羟甲基氨基甲烷缓冲液的配置：Tris 碱0. 121加80ml Milli-Q水溶解，用1M盐酸调节PH值为8. 5,定容至100ml，验证PH值， 灭菌，肝素钠溶液配置：3mg/ml肝素钠的Milli-Q水溶液100ml，用0. 1M NaOH及1%醋酸 调节pH值为4. 2,配好的肝素钠溶液，灭菌； 第二步、将第一步中制备的冻干物溶于三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，配好的溶液中保 证多巴胺浓度为4mg/ml ;取48孔板，每孔中放置配置好的溶液，用镊子每孔放1枚钢片，结 束钢片上多巴胺的聚合反应：将钢片自溶液中取出，置于新的48孔板中，Milli-Q水清洗， 清洗后氮气吹干； 第三步、钢片的包被：将第二步中制得的钢片进行血管内皮生长因子和肝素的包被，包 被层数为1-10层；具体包被过程为：将血管内皮生长因子溶于pH值为7. 4的PBS缓冲液 中，配置成l〇〇ug/ml溶液，将制得的钢片浸入血管内皮生长因子溶液中，4°C条件下反应， 12小时后取出钢片，去离子水冲洗，氮气吹干，制得的钢片表面生成有血管内皮生长因子 层，血管内皮生长因子的等电点为8. 5,通过调节pH值能够使血管内皮生长因子溶液和肝 素钠溶液分别带正电、负电，然后一层肝素一层血管内皮生长因子再一层肝素这样层层静 电吸附直至所需层数； 第四步、包被金黄色葡萄球菌A蛋白：将金黄色葡萄球菌A蛋白中加入PBS，配置成 lmg/ml溶液，再进行稀释，最终配置成0. lmg/ml金黄色葡萄球菌A蛋白溶液，将上步中获得 的支架置于金黄色葡萄球菌A蛋白溶液中，4°C冰箱中静置24小时，将钢片取出用pH值为 7. 4的PBS溶液清洗3次，氮气吹干； 第五步、进行封闭：将上步中被金黄色葡萄球菌A蛋白包被后的支架浸入10mg/ml牛血 清白蛋白中，4°C下静置封闭，取出用PBS清洗，氮气吹干，然后配置⑶34抗体溶液，将封闭 后的支架浸入CD34抗体溶液中，4°C条件下反应12小时，取出用PBS清洗，常温干燥；进一 步，进行CD34抗体的荧光标记和表征：包被抗体CD34的支架中取一枚进行荧光标记，之前 用兔血清封闭，异硫氰酸荧光素标记鼠抗兔IgG抗体配置成混合溶液，将包被抗体CD34的 支架与标记物37°C条件下共浴1小时，常温下过夜干燥，固定于载玻片上，送检免疫荧光。
【文档编号】A61L31/10GK104083805SQ201410355973
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】宋春莉, 李倩, 刘斌, 刁鸿英, 赵丽艳, 张基昌, 于雲鹏, 史永峰, 王冠, 王金鹏 申请人:吉林大学