专利名称：一种治疗人宫颈癌的树突状细胞疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗人宫颈癌的树突状细胞疫苗。
背景技术：
1995年6月，国际癌症研究中心(IRAC)公布的研究结果证实人类乳头瘤病毒 (humanpapillomavirus, HPV)与宫颈癌有非常密切的因果关系。HPV至少存在100个 型别，可分为低危型(如HPV6、 ll等)和高危型(如HPV16、 18、 31、 33、 45和58 等)。高危型HPVs的持续性感染，其中一部分可导致宿主细胞发生宫颈上皮内瘤样 病变(CIN)、宫颈癌以及其它肿瘤，而HPV16、 18是主要高危型别，在HPVs所致的宫 颈癌中占70%左右。高危型HPVs的基因组编码早期蛋白El、 E2、 E4-7和晚期衣壳蛋 白L1、 L2，但不编码E3和E8蛋白。早期蛋白主要涉及病毒基因组的复制、转录调节 和诱导宿主细胞发生转化，晚期蛋白L1具有自我组装成病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)的特性。2006年6月，FDA批准宫颈癌预防性疫苗上市，该疫苗利用L1 蛋白能形成VLP，在人和动物体内产生中和性抗体，这是继HBV之后的癌症预防性疫 苗。从长远来看，将会减少宫颈癌的发生。目前临床上宫颈癌的传统治疗方法疗效 不佳，宫颈癌患者化疗有效率一般小于20%，放疗或手术后约四成复发，且预后极 差(5年生存率仅3.2%—13%，只能姑息治疗)。目前公认治疗后残余的HPV病毒颗 粒或DNA可能是其高复发的主要原因之一。研究证明该疫苗不能治疗宫颈癌及被 HPVs感染的患者，因此研发治疗宫颈癌的药物或疫苗是非常必要的，也是宫颈癌研 究的热点。
宫颈癌的发生是一个渐进的过程，主要是由于癌蛋白E6和E7分别与p53和RB相 互作用后，基因组在E2区断裂，并整合到宿主细胞染色体上，这一过程使抑癌基因 功能受损、DNA修复发生障碍、细胞凋亡减少、最终导致细胞永生化；染色体的突 变、杂合子的缺失、原癌基因和端粒酶的激活在HPV诱导的宫颈癌的致病机制中起 重要作用。HPV感染的CIN和宫颈癌患者体内普遍存在免疫缺陷、病人外周血活化T 淋巴细胞及T淋巴细胞总数下降、CD4+T淋巴细胞数量明显减少、MHC表达下降、NK 细胞活性下降和癌细胞转移播散的现象。Langerhan细胞数目减少使它递呈病毒抗原 -HLA给CD4+的功能受损。调节性T细胞的存在，有证据表明HPV16持续性感染的患者 体内循环的CD4+CD25hiCTLA4+FoxP3+调节性T细胞增加，宫颈癌患者宫颈病变处有CD4+CD25hiCTLA4+FoxP3+调节性T细胞的浸润，说明宫颈癌患者存在对HPVs感染的 免疫耐受。因此，宫颈癌治疗性疫苗的关键是如何增强宿主对HPVs感染的细胞免疫 和粘膜免疫反应，打破免疫耐受。
此外，HPV是一个多型别的病毒，且缺乏群抗原决定簇，必须要开发多价疫苗 才能真正起到防治效果。不同地区HPV感染型别构成比存在差异。大多数地区是 HPV16和18型，少数地区如西非以HPV45型占优势，在南美则以HPV39型和HPV59型多 见。HPV58型在非洲、北美、南美洲、东南亚及欧洲均较为罕见，在宫颈癌中的感 染率只有2%;而在中国台湾和香港的宫颈癌患者中，感染率却相对较高，尤其在香 港的宫颈癌患者中，HPV58的检出率直追HPV16，高达33.3%。 Huang等在对中国上海 部分宫颈癌患者肿瘤组织的研究中发现，HPV阳性标本中，HPV52和58的检出率达48 %，而通常认为的主要致癌的HPV16和18型的阳性率仅为4296。最近陕西等地的统计 报导，宫颈癌患者中HPV58检出率亦高达近2(m。由于多价疫苗开发不仅受载体容量 及生产成本等限制，不常见亚型的保护效果也很难证实，目前国外研究仍以l-2价 最常见病毒类型疫苗为主，国内对HPV58型感染亦未足够重视。迄今国际上进入临 床试验阶段的HPV候选疫苗中没有一个是针对58亚型的(包括Merck公司的HPV四价 疫苗)，这极可能导致相当长时间内进口疫苗在我国不适用。因此，自主开发针对 我国国情的HPV疫苗迫在眉睫。
宫颈癌的致病因子为外源性高危型HPVs的感染，其早期蛋白E6和E7为癌蛋白， 其持续表达为肿瘤细胞转化和维持恶性特征所必需，是理想的药物和治疗性疫苗作 用的靶位。治疗性疫苗主要以E6和E7作为靶蛋白，其目的是诱导机体产生特异性细 胞免疫反应，清除己感染的HPV，治疗由感染引起的癌前病变和肿瘤。但高危型HPV 的E6和E7是公认的致癌因子，在HPV相关的永生化和致瘤性中起着重要作用。E7蛋 白能失活肿瘤抑制蛋白Rb，并有激活端粒酶、活化周期素E和A的作用；E6可通过 E6AP-泛素途径降解P53蛋白，使P53蛋白控制的G1/S节点失去控制，导致细胞染色 体不稳定和基因突变增加，使外源DNA整合到染色体中的机率大大升高；同时还可 以作用于凋亡相关蛋白抑制细胞凋亡、激活端粒酶、维持端粒长度使细胞永生化。 所以，必须去除E6和E7的转化活性方能用于疫苗构建。
研究表明，E6的N端主要与蛋白的稳定性有关，N端发生缺失突变会显著影响蛋 白在体外的半衰期。E6的两个锌指区都是病毒转化活性和引起蛋白反式激活所必需 的，均与蛋白间的相互作用有关。许多资料证实，E6的C端含有大多数的抗原表位。
5Nakagawa等详细研究了HPV18型E6蛋白各位点与HEK293细胞转化和p53失活的关系， 发现除锌指结构外，L-52突变对其影响也非常显著。
E7蛋白为全长105个氨基酸残基的酸性蛋白，是HPV18的主要转化蛋白。E7蛋白 分为3个功能区1区和2区与腺病毒E1A的第1、 2保守区高度同源；3区为锌指区。2 区中的"L-X-E-X-C"被认为是结合Rb的关键位点。研究表明，该位点突变可明显 降低E7蛋白对猴CA-1细胞系的转化活性，但并不影响人角化细胞的永生化，而锌 指区的突变则可完全破坏E7蛋白的转化和永生化能力。E7蛋白可能是二聚体的形式 存在，此二聚体以"Cys-X-X-Cys"基序与Zine结合，l个锌指突变会减弱其与Zine 的结合能力、縮短半衰期、降低稳定性、丧失其转化性；而2个锌指突变则彻底失 去其与Zine结合的能力、引起半衰期的严重縮短、完全丧失其转化性，并有可能丧 失抗原性。此外，有研究报导对HPV16型E7蛋白进行T20V突变，可以提高其所诱导 的CTL反应，但不影响E6和E7蛋白的功能活性。
近10年来HPV疫苗研究非常活跃，合成多肽疫苗、蛋白质疫苗与DNA疫苗一 样，免疫功效较差，即使辅以各种佐剂，仍不能完全预防同型HPV感染或使已生成 肿瘤消退，多肽疫苗的应用还受MHC-1类分子限制，短期内难有大的进展。相比之 下，具有长期、大规模人类接种史的病毒载体疫苗才是目前发展中国家可行性最强 的HPV疫苗策略。其中腺病毒载体不但外源基因表达水平高，引起免疫反应强而持 久，制备方法成熟，免疫途径方便，还能诱发有效粘膜免疫的病毒载体，已取代逆 转录病毒成为当前应用最广泛的载体。加之近年来复制缺陷腺病毒不断重组改良， 其使用安全性已大大增强，用以开发HPV疫苗的条件进一步成熟。
增强宿主的免疫反应、突破机体对肿瘤的自身耐受是成功研发宫颈癌治疗性疫 苗的重要一环。专业的APCs网络控制免疫和耐受，通过提供前炎性细胞因子和加工 处理抗原并递呈给T细胞，介导对病毒感染和癌细胞的先天性和获得性免疫反应。 在组织中能捕获病原体编码的抗原的DCs被病原体诱导的炎性反应激活，DCs的激活 分为两期，即成熟期和执行功能期，使装载抗原的DCs迁移到外周淋巴结激活T细胞 是—个基本步骤(Gliboa E. DC-based cancer vaccines丄Clin. Invest. 2007; 117: 1195-1203.)。肿瘤不同于感染性病原体，不产生有助于DCs激活的有效的炎症反应， 结果是其免疫反应非常弱且无效。对于肿瘤患者，免疫治疗的主要目的在于克服这 种缺陷，提供使DCs成熟的条件，使之成为有免疫刺激功能的APCs。DCs含有Toll样受体(Toll-like receptor, TLRs) ， TLR信号通过激活丝裂原激 活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)和核因子-kB (NF-kB)使DCs 成熟，DCs介导各种细胞因子的表达。S0CS1在DCs中表达，SOCSl作为一个假底物 抑制剂介导JAK2的降解，抑制STAT (signal transducer and activator of transcription) 信号，是诸如IFN-y、 IL-2、 IL-7、 IL-12和IL-15等细胞因子的重要负调节因子
(Kubo M, Hanada T and Yoshimura A. Suppressors of cytokine signaling and immunity.Nat.Immunol. 2003; 4: 169-176; Alexander WS and Hilton DJ. The role of suppressors of cytokine signaling (SOCS) proteins in regulation of the immune response.Annu. Rev. Immunol. 2004; 22: 503-529) 。 S0CS1基因敲除的新生小鼠死于 不可控制的大量产生的IFN- y (Marine JC， Topham DJ, McKay C, Wang D, Parganas E, Stravopodis D, Yoshimura A， Ihle JN. SOCS1 deficiency causes a lymphocyte-dependent perinatal lethality. Ce〃. 1999; 98:609—616; Alexander WS, Starr R, Fenner JE， Scott CL, Handman E, Sprigg NS, Corbin JE, Cornish AL, Darwiche R, Owczarek CM, Kay TW, Nicola NA， Hertzog PJ， Metcalf D, Hilton DJ. SOCS1 is a critical inhibitor of interferon gamma signaling and prevents the potentially fatal neonatal actions of this cytokine. Ce〃. 1999; 98:597-608)。有研究用RNAi技术使S0CS1沉默， 处理后的DCs能使已建立黑色素瘤的小鼠肿瘤的生长受到抑制(ShenL， Evel-kabler K， Strube R and Chen SY. Silencing of SOCS 1 enhances antigen presentation by dendritic cells and antigen-specific anti-tumor immunity. Nature Biotechnology. 2004; 22(12): 1546-1553; Evel-kabler K， Song XT, Aldrich M, Huang XF and Chen SY, SOCS1 restricts dendritic cell's ability to break self tolerance and induce antitumor immunity by regulating aIL-12 production and signaling丄Clin. Invest. 2006; 116: 90-100)，表明S0CS1可以作为靶标进行肿瘤的基因治疗，有利于突破机体对肿瘤 的免疫耐受。
S0CS1的作用的原理为抑制抑制因子或抑制免疫减弱因子。实现这个目标有 不同的方法，如化学合成RNAi、质粒转染、多肽或其相应的抗体。但抗体及质粒转 染如何进入细胞的问题，多肽和化学合成的RNAi存在稳定性问题，其中合成的RNAi 还存在对细胞的毒性问题，而复制缺陷型的腺病毒能有效地解决这个问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-S0CS1。本发明所提供的复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-S0CS1是能够表达如下双链 RNA的复制缺陷型重组腺病毒，所述双链RNA的正义链的序列如序列表中序列11 所示；所述双链RNA的反义链的序列如序列表中序列12所示。
所述双链RNA的编码shRNA的一条链的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列9 所示，所述双链RNA的编码shRNA的互补链的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列 10所示。
所述复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl是用Adeno-X表达系统制备得到的。
上述复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl按照如下方法制备
1) 将所述双链RNA的编码DNA插入Adeno-X表达系统的RNAi-Ready pSIRN-Shuttle的多克隆位点，得到重组表达载体RNAi-SOCSl-pShuttle;
2) 用PI-Sce I与I-Ceu I双酶切所述重组表达载体RNAi-SOCSl-pShuttle,将得 到的含有所述双链RNA的编码DNA的酶切片段与Adeno-X表达系统的Adeno-X病毒 DNA连接，将得到的连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，得到重组腺病毒DNA， 再将该重组腺病毒DNA转染HEK293细胞，得到复制缺陷型重组腺病毒。
本发明的另一个目的是提供一种修饰的树突状细胞。 本发明所提供的修饰的树突状细胞是用复制缺陷型重组腺病毒
rAd-HPV16, 18， 58mE67和上述复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl感染树突状
细胞得到的；
所述重组腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67是将转录融合三基因片段插入复制缺陷 型腺病毒表达载体得到重组腺病毒载体，再将该重组腺病毒载体导入细胞中得到重 组腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67;
所述转录融合三基因片段包括HPV16mE67、 HPV18mE67和HPV58mE67以及连接 三者的短核苷酸片段；
所述HPV16mE67编码的氨基酸序列是序列表中序列6;所述HPV18mE67编码的 氨基酸序列是序列表中序列7;所述HPV58mE67编码的氨基酸序列是序列表中序列 8;所述连接HPV16mE67、 HPV18mE67和HPV58mE67的短核苷酸片段为核糖体内部进 入位点。
所述HPV16mE67的脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列1;所述HPV18mE67的 脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列2;所述HPV58mE67的脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列3;所述核糖体内部进入位点的脱氧核糖核苷酸序列是序列表中序列4。
所述转录融合三基因片段的脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列5。 本发明的第三个目的是提供一种治疗人宫颈癌的重组树突状细胞疫苗。 本发明所提供的治疗人宫颈癌的重组树突状细胞疫苗，它的活性成分是上述重 组树突状细胞细胞。
含有复制缺陷型重组腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67和上述复制缺陷型重组腺病 毒rAd-RNAi-S0CS1的重组菌也属于本发明的保护范围。
上述修饰的树突状细胞或重组菌可用于制备预防和/或治疗人宫颈癌疫苗。
根据我国HPV感染型别的分布特点，选择HPV16、 18和58这三个最常见的亚型， 对影响其转化活性和提高CTL反应的位点进行突变，对E6基因，选择突变其P53结合 位点及其中一个锌指结构；对E7基因，选择突变其Rb结合位点和其中一个锌指，在 不影响蛋白稳定性和免疫原性的前提下，彻底去除其转化活性。构建了各亚型HPV 的E6和E7蛋白的融合基因，并将其转入腺病毒载体中构建成重组腺病毒 rAd-HPV16，18， 58mE67。
为了突破机体对肿瘤的免疫耐受，选用诸如IFN-Y、 IL-2、 IL-7、 IL-12和IL-15 等细胞因子的负调节因子S0CS1为靶标，用RNA沉默技术(RNA silencing)使S0CS1基 因沉默，然后将其转入腺病毒载体中构建成重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl。将重组腺 病毒rAd-RNAi-SOCSl与重组腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67同时感染分离培养的DCs， 不需要多肽或蛋白质的脉冲，避免了在脉冲过程中加入RNA而导致的降解。然后用 LPS使DCs成熟，回输体内，对荷瘤的个体产生强烈的免疫反应，突破机体对肿瘤细 胞或病毒感染细胞的免疫耐受，在小鼠肿瘤模型的治疗性实验中，具有良好的治疗 效果。
本发明的总体方案路线图如图l所示。
图1为实验的总体方案路线图
图2为HPV16、 18和58型E6和E7基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果 图3为重组质粒pAdeno-X-HPV16, 18， 58mE67转染HEK293细胞8天后细胞的形
态图4为重组腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67转染HEK293细胞后的Western Blot 检测结果
图5为重组腺病毒rAd-RNAi-S0CS1感染DCs细胞两天后细胞的形态
图6A为RT-PCR分析重组腺病毒rAd-RNAi-S0CS1或rAd-RNAi-mS0CSl感染DCs 细胞48h后S0CS1的表达
图6B为感染重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl或rAd-RNAi-mSOCSl的DCs细胞中 S0CS1 mRNA的相对比例
图7为荷瘤小鼠的存活率
图8为CTL检测结果
图9A为产IFN- y脾细胞的染色结果
图9B为ELISPOT试剂盒分析IFN- y的结果
图10为各组小鼠血清中IL-12的p40亚单位的水平
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见
《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratoiy Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
所用引物及DNA序列如无特别说明均由上海生工合成。 实施例1、 HPV E6和E7基因的来源及其突变
HPV基因组DNA来自深圳市中医院门诊病人(年轻女性)的宫颈刮片标本，PCR 扩增，测序后证实为HPV的基因组DNA。以该HPV基因组DNA为模板，分别设计HPV16、 18和58型E6和E7基因的特异性引物，扩增HPV16型E6基因的特异性引物为PI 和P2，扩增HPV16型E7基因的特异性引物为P3和P4，扩增HPV18型E6基因的特 异性引物为P5和P6，扩增HPV18型E7基因的特异性引物为P7和P8，扩增HPV58 型E6基因的特异性引物为P9和P10，扩增HPV58型E7基因的特异性引物为Pll 和P12 (具体的引物序列如表l所示)，用DNA聚合酶分别扩增HPV16、 18和58 型E6和E7基因，并在引物上添加相应的酶切位点，PCR反应体系如下
10d證Mixture 1
10XPyrobest Buffer II,
Pyrobest DNA polymerase0.5nl
DNA模板WlOng)
上游引物(20^im)2.5|il
下游引物(20拜)2，
dH2073.5|il
总体积100 pi
PCR反应条件先95。C预变性5min;然后95°C lmin， 56°C lmin， 72°C lmin， 共32个循环，最后72'C延伸lOmin。
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，具体检测结果如图2所示。其中， M为DL2000 Marker,泳道1-3分别为HPV16、 18和58型E6基因PCR扩增产物的琼 脂糖凝胶检测结果；泳道4-6分别为HPV16、 18和58型E7基因PCR扩增产物的琼 脂糖凝胶检测结果。结果表明，获得大小为500bp的HPV16、 18和58型E6基因和 大小为300bp的HPV16、 18和58型E7基因。
PCR扩增产物经纯化后分别与pMD18T simple (购自Takara公司)相连并进行 测序，测序结果表明，扩增得到的HPV16、 18和58型E6基因的脱氧核糖核苷酸序 列与GenBankAccenssion Number EF029179、 EF202153和D90400的序列一致，扩 增得到的HPV16、 18和58型E7基因的脱氧核糖核苷酸序列与GenBankAccenssion Number EU430687、 EF202153和D90400的序列一致。
分别对上述扩增得到的HPV16、 18和58型E6和E7基因的与转化活性相关的 位点以及能增强细胞免疫功能的部位进行突变，突变后的序列经测序分析证实突变 成功，具体的突变方法如下
以上述HPV16型E6基因的PCR扩增产物为模板，以PM1和PM2为引物进行 PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序，将测序结果正确的 重组质粒命名为pMD18T-16E6ml;再以pMD18T-16E6ml为模板，以PM3和PM4 为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序，将测序 结果正确的PCR产物命名为HPV16mE6。以上述HPV16型E7基因的PCR扩增产物为 模板，以PM5和PM6为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18T simple相 连并进行测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pMD18T-16E7ml;再以pMD18T-16E7ml为模板，以PM7和PM8为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物 与pMD18T simple相连并进行测序，将测序结果正确的PCR产物命名为HPV16mE7。 以上述HPV18型E6基因的PCR扩增产物为模板，以PM9和PM10为引物进行PCR 扩增，将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序，将测序结果正确的重组 质粒命名为pMD18T-18E6ml;再以pMD18T-18E6ml为模板，以PM11和PM12 为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序，将测序 结果正确的PCR产物命名为HPV18mE6。以上述HPV18型E7基因的PCR扩增产物为 模板，以PM13和PM14为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18T simple 相连并进行测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pMD18T-18E7ml;再以 pMD18T-18E7ml为模板，以PM15和PM16为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产 物与pMD18T simple相连并进行测序，将测序结果正确的PCR产物命名为HPV18mE7。 以上述HPV58型E6基因的PCR扩增产物为模板，以PM17和PM18为引物进行PCR 扩增，将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序，将测序结果正确的重组 质粒命名为pMD18T-58E6ml;再以pMD18T-58E6ml为模板，以PM19和PM20 为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序，将测序 结果正确的PCR产物命名为HPV58mE6。以上述HPV58型E7基因的PCR扩增产物为 模板，以PM21和PM22为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18T simple 相连并进行测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pMD18T-58E7ml;再以 pMD18T-5犯7ml为模板，以PM23和PM24为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产 物与pMD18T simple相连并进行测序，将测序结果正确的PCR产物命名为HPV58mE7。 其中，HPV16mE6是将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第57位的亮氨酸(L) 突变为甘氨酸(G)，第110位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G) ; HPV16mE7是 将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第22位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G)， 第91位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G) ; HPV18mE6是将其编码的氨基酸序列 的自氨基末端第第52位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G)，第68位的半胱氨酸(C) 突变为甘氨酸(G) ， HPV18mE7是将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第第27位的 半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)，第98位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G); HPV58mE6是将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第第50位的亮氨酸(L)突变为甘 氨酸(G)，第66位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G) ; HPV58mE7是将其编码的 氨基酸序列的自氨基末端第第26位的谷氨酰胺(E)突变为甘氨酸(G)，第92位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)。
表l引物设计
扩增引物引物序列突变引物引物序列
基因编号(5， -3')位点编号(5, -3，)
舰6PlGGG7TWfi4 ATGGACCAAAAGAGA16E6 L57GPM1TTTTCGGGATGGTTGCATAGTATATAG
P2TCTA46T7T CAGCTGGGTTTCTCPM2GCAAAGTCATATACCTCACGTCGC
16E7P3GGC腐C7T CATGGAGATACA16E6 C110GPM3TAATTAGG^GTATTAACTGTCAAAAGCC
P4GG6WCT TTATGGTTTCTGAPM4ACAAATCACACAACGGTTTGTTGTA
16E7 L22GPM5ACTGAT55CTACTGTTATGAGC
PM6TGTCTCTGGTTGCAAATCTAAC
18E6P5TAtf釘7T ATGGCGCGCTTTGA16E7 C91GPM7AGGAATTGTG^^CCCATCTGTTC
P6CGGGC6TC TTCTACTTGTGPM8AGTGTGCCCATTAACAGGTCTTCCAAAG
18E7P7T6Td CATGGACCTAAGG18E6 L52GPM9CATTTAAAGAT迎ATTTGTGGTGTATAGA
P8TTTCTO^C1 TTACTGCTGGGAPM10CAAATTCAAATACCTCTGTAAGTTCCAA
18E6 C68GPM11GCATGCCATAAAgGTATAGATT
PM12AGCATGGGGTATACTGTCTCTA
58E6P9TTAOT(S4ff ATGTTCCAGGACG18E7 C27GPM13GTTGACCTTCTA gGTCACGAGCA
P10GGCft!47TC CACTTGTGTTTGTCPM14CGGAATTTCATTTTGGGGC
58E7PllTC(J雄7T AGAGGAAACAACCC18E7 C98GPM15CTGTCCTTTGTG^GTCCGTGGTGT
P12TGC6K47CT TGTTTATTGCTGPM16GGTGTTCAGAAACAGCTGCTGGAATG
P12'TT6Tft7(X6V: TGTTTATTGCTG58E6 L50GPM17TTGCAGATGGCAGAATAGTGTATAGAG
PM18ATACAAAGTCATATACCTCAGATCGCTG
IRESP13TTC^7CT TTACCTCTCCCTC58E6 C66GPM19AGTATGTAAAGTGgGCTTACGATTGC
P14GCG^77T GGTGGCCATAPM20GCAAATGGATTTCCATCTCTATACAC
P14'TACTCK4C1 TGTGGCCATATTATC58E7 E26GPM21ATTCTGCTACG^CAATTATGTGAC
PM22AGGTCAGTTGGTTCAGGATGTAAATC
58E7 C92GPM23CATTGTGQGCCCTAGCT
PM24GTACATGTGCCCATAAGCA
注表中斜体字部分为酶切位点，带下划线部分为突变位点。 实施例2、融合基因的获得及mE67基因转化活性去除情况检测 一、融合基因的获得
用T-Vector载体(购自Takara公司)分别将上述实施例1获得的野生型HPV16 的E6和E7基因、HPV18的E6和E7基因、HPV58的E6和E7基因以及突变后的HPV16 的mE6和mE7基因、HPV18的mE6和mE7基因、HPV58的mE6和mE7基因相连接， 产生融合基因HPV16E67、HPV18E67、HPV58E67、HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67， 具体的连接方法如下将HPV16E6、HPV16mE6用引物Pl、 P2进行PCR扩增，HPV16E7、HPV16mE7用引物P3、 P4进行PCR扩增，电泳产物分别用历'"dl1进行酶切，回收 酶切产物，将HPV16E6与HPV16E7， HPV16mE6与HPV16mE7经酶切后的产 物用T4连接酶进行连接，然后以连接产物为模板，以P1和P4为引物进行PCR扩 增，将PCR扩增产物与pMD18T simple相连，将得到的含有融合基因的载体分别命 名为T-HPV16E67和T-HPV16mE67;同样的方法，将HPV18E6、 HPV18mE6用引物P5、 P6进行PCR扩增，HPV18E7、 HPV18mE7用引物P7、 P8进行PCR扩增，电泳产物分 别用进行酶切，回收酶切产物，将HPV18E6与HPV18E7， HPV18mE6与HPV18mE7 经5"WI酶切后的产物用T4连接酶进行连接，然后以连接产物为模板，以引物P5 和P8为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18T simple相连，将得到的含有 融合基因的载体分别命名为T-HPV18E67和T-HPV18mE67;将HPV58E6、 HPV58mE6 用引物P9、 P10进行PCR扩增，HPV16E7、 HPV16mE7用引物Pll、 P12进行PCR扩增， 电泳产物分别用Aco^E进行酶切，回收酶切产物，将HPV58E6与HPV58E7， HPV58mE6 与HPV58mE7经^bo皿酶切后的产物用T4连接酶进行连接，然后以连接产物为模板， 以引物P9和P12为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18T simple相连，将 得到的含有融合基因的载体分别命名为T-HPV58E67和T-HPV58mE67。
对T-HPV16mE67、 T-HPV18mE67和T-HPV58mE67质粒进行测序，结果表明 HPV16mE67的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如 序列表中序列6所示；HPV18mE67的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示， 其编码的氨基酸序列如序列表中序列7所示；HPV58mE67的脱氧核糖核苷酸序列如 序列表中序列3所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列8所示。
二、 HPV16mE67、 HPV18mE67和HPV58mE67基因转化活性去除情况检测
1、转基因细胞的获得
将上述步骤一获得的融合基因HPV16E67、 HPV18E67、 HPV58E67、 HPV16mE67、 HPV18mE67和HPV58mE67用vV力el和5<3// 1酶切后，分别连入真核表达质粒 pIRES2-EGFP (购自BD公司)的^力el和"3/^1酶切位点间，得到含有融合基因 HPV16E67的重组表达载体pIRES2-HPV16E67，含有融合基因HPV18E67的重组表达 载体pIRES2-HPV18E67，含有融合基因HPV58E67的重组表达载体pIRES2-HPV58E67， 含有融合基因HPV16mE67的重组表达载体pIRES2-HPV16mE67，含有融合基因 HPV18mE67的重组表达载体pIRES2-HPV18mE67和含有融合基因HPV58mE67的重组表 达载体pIRES2-HPV58mE67。将上述构建的重组表达载体用脂质体法(详见
14Lipofectamin 2000试剂盒说明)分别转染Balb/c 3T3细胞，经G418筛选，得到含 有相应基因的细胞克隆。同时以未转入任何真核表达质粒的Balb/c 3T3细胞作为 对照，用以观察去转化活性情况。
2、 常规体外细胞培养，观察其接触抑制情况
将质粒pIRES2-HPV16E67、 pIRES2-HPV18E67、 pIRES2-HPV58E67、 pIRES2-HPV16mE67、 pIRES2-HPV18mE67和pIRES2-HPV58mE67分别转染Balb/c 3T3 细胞，经G418筛选，得到含有相应基因的细胞克隆。培养上述转基因细胞3天后， 进行光镜观察，结果发现，转入质粒pIRES2-HPV16E67、 pIRES2-HPV18E67、 pIRES2-HPV58E67的细胞呈融合状并重叠生长，提示失去生长接触抑制，而转入质 粒pIRES2-HPV16mE67、 pIRES2-HPV18mE67、 pIRES2-HPV58mE67的细胞始终存在接 触抑制现象。
3、 软琼脂培养
在直径为35mm的塑料培养皿上铺一层0. 35%的琼脂，每个培养皿中分别接种5 X 104个对数生长期的上述步骤1获得的转基因的Balb/c 3T3细胞和未转入任何真 核表达载体的Balb/c 3T3细胞，每种处理5个重复，37°C 5%0)2常规培养3周， 倒置显微镜下观察集落形成情况。结果表明，在软琼脂培养基上培养2-3周后，转 入质粒pIRES2-HPV16E67、 pIRES2-HPV18E67、 pIRES2-HPV58E67的细胞呈集落性生 长，而转入质粒pIRES2-HPV16mE67、 pIRES2-HPV18mE67、 pIRES2-HPV58mE67的细 胞和未转基因的Balb/c 3T3细胞一样，均未见50个细胞以上的集落形成。
4、 裸鼠体内致瘤实验
取Balb/c小鼠(购自广州中医药大学实验动物中心)，每只小鼠皮下接种5 X106个上述步骤l的获得的转基因和未转基因的Balb/c 3T3细胞，每种细胞接种 5只小鼠，观察小鼠皮下成瘤情况。结果表明，接种40天后，用转入质粒 pIRES2-HPV16mE67、 pIRES2-HPV18mE67、 pIRES2-HPV58mE67的Balb/c 3T3细胞接 种的小鼠和用未转基因的Balb/c 3T3细胞接种的小鼠无一成瘤，而用转入质粒 pIRES2-HPV16E67、 pIRES2-HPV18E67、 pIRES2-HPV58E67的Balb/c 3T3细胞接种的 小鼠有80%皮下成瘤，瘤的平均直径为2. 5mm。
软琼脂培养和裸鼠体内致瘤实验证明，突变后的三个亚型的mE67基因已经失 去E6和E7基因的转化活性，为疫苗的安全使用提供了保障。
实施例3、重组腺病毒质粒pAdeno-X-HPV16， 18, 58mE67的构建将上述实施例2构建的HPV16mE67基因经顺el和fe/dH酶切后与用同样酶切 的载体pCDNA 3. 1 (+)相连，产生重组质粒pCDNA3. 1 (+) 16mE67;以质粒pIRES2-EGFP (购自BD公司)为模版，用P13、 P14为引物进行PCR扩增，产物分离纯化后得到 663bp的IRES2片段，对IRES2片段进行测序，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中 序列4所示。将该IRES2片段用"^tHI和双酶切后连入质粒 pCDNA3. 1 (+) 16mE67的勘/zHI和AcoW酶切位点间，得到重组表达载体pCDNA3. 1( + ) 16mE67-IRES2。将上述实施例2构建的HPV18mE67基因经&0皿和酶切后与 用同样酶切的载体pCDNA 3. 1 (+)相连，产生重组质粒pCDNA3. 1 (+) 18mE67;以质粒 pIRES2-EGFP (购自BD公司)为模版，用P13、 P14，为引物进行PCR扩增，将PCR 扩增产物用万朋别和Xhol双酶切后连入质粒pCDNA3. 1 (+) 18mE67的5朋肌和Xhol 酶切位点，得到重组表达载体pCDNA3. 1 ( + ) 18mE67-IRES2。然后用和iT oI 双酶切该pCDNA3. 1 ( + ) 18mE67-IRES2质粒，回收1471bp的小片段，并将其连入 上述pCDNA3. 1 ( + ) 16mE67-IRES2的和J力o/位点间，将产生的重组表达载 体命名为pCDNA 3. 1(+) -Kozak 16mE67-IRES2-18mE67-IRES2。将上述实施例2构 建的HPV58mE67基因用P9、P12，为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物经化ol和7Vofl 双酶切后，与用同样酶切的载体pCDNA3. l(-) (Invitrogen公司)相连，产生重组 质粒pCDNA3. 1 (_) 58mE67，然后用顺el和勘I双酶切上述pCDNA 3. 1 (+) - Kozak 16mE67-IRES2-18mE67-IRES2质粒，回收2915bp的小片段，并将其连入上述 pCDNA3. l(-)58mE67的顺el和J力ol位点间，将产生的重组表达载体命名为 pCDNA3. 1(-) 16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67。
用顺el和tV"I双酶切重组表达载体pCDNA3. 1 (-) 16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67，得到3. 7kb的融合基因 16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67。对该融合基因进行测序，测序结果表明， 16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5所 示。
融合基因16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67中均去除了 HPV16mE6、 HPV18mE6和HPV58mE6的E6终止密码子和HPV16mE7、 HPV18mE7和HPV58mE7的E7 起始密码子，而保留了E6起始密码子和E7终止密码子。以上操作均按常规分子生 物学操作规程及Takara MutanBEST Kit (Takara公司)说明进行。
将重组表达载体pCDNA3. 1 (-) 16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67经顺el和KI双酶切后插入穿梭质粒pShuttle2 (购自BD公司)的顺el和#"1酶切位点间， 得到重组表达载体pShuttle-16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67。将重组表达载体 pShuttle2-16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67用PI-Sce I和I-Ceu I双酶切(New
England Lab公司)，酶切体系如下试剂体积
PI-Sce 1(1 un帥l)2pl
I-Ceu I (5 units/pl)0，
重组表达载体pShuttle-16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67(500ng/nl)2^1
10xDouble Digest Buffer3^1
醇BSA3^1
dH205pl
总体积30pl
将酶切体系混匀后置37。C水浴中精确酶切3h，回收并纯化酶切产物。将回收 的酶切产物用Takara ligation Mixture连入Adeno-X表达系统(购自BD公司)中的 Adeno-X病毒DNA中，置PCR仪中16。C连接过夜。将连接产物用Swa I酶切消化(Swa I酶切位点位于PI-SceI与I-CeuI之间)，以去除未能与Adeno-X病毒DNA连接的 基因片段。再次回收酶切产物，将融合基因16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67 与Adeno-X病毒DNA正确连接的重组腺病毒载体命名为Adeno-X-HPV16, 18, 58mE67。
用重组腺病毒载体Adeno-X-HPV16, 18， 58mE67转化大肠杆菌DH5a， A即抗性平 板挑选阳性克隆，分别以表l中的P3和P4、 P7和P8、 P11和P12为引物进行PCR 扩增。提取重组腺病毒载体Adeno-X-HPV16， 18， 58mE67的DNA，将所得的重组质粒 命名为pAdeno-X-HPV16， 18， 58mE67。对重组质粒pAdeno-X-HPV16,18, 58mE67进行 PCR扩增、酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组质粒送上海博亚测序。Pacl酶切 pAdeno-X-HPV16, 18， 58mE67用于转染HEK293细胞。
实施例4、重组缺陷性腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67的制备与滴度的测定
一、重组缺陷性腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67的制备
用线性化后的重组质粒pAdeno-X-HPV16， 18， 58mE67转染HEK293细胞，培养转 染后的细胞至细胞出现明显的病态效应(cytopathic effect, CPE)。转染8天后，细胞 的具体形态如图3所示。其中，A为转染重组质粒pAdeno-X-HPV16, 18， 58mE67的 HEK293细胞的形态，B为正常HEK293细胞的形态。重组腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67的制备按照Adeno-X Expression System User Manual进行，具体过程如下
(1) 用PBS洗涤上述出现明显病态效应的HEK293细胞2次，直接将HEK293细 胞吹打下来(不用胰酶)，1，500rpm室温下离心5min; 500|_il PBS重悬细胞；
(2) -20。C和37"C水浴反复冻融细胞3次，每次融化后短时间混匀细胞悬液；
(3) 12000rpm室温离心10min，收集含病毒的上清，加入10%甘油，过滤除菌后 作为重组病毒原液置-70'C冻存备用；
(4) 培养HEK293细胞，待细胞铺满瓶底50-70%时，加入步骤(3)制备的病毒原 液250ul，继续培养；
(5) 观察细胞的病态效应，待50%以上的细胞从培养板底浮起时，重复上述 (1)-(3)步骤制备重组腺病毒rAd-HPV16，18，58mE67， -20。C存放，以备测定病毒滴
度或进一步制备高滴度病毒用。
二、 重组腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67的滴度测定
因HEK293细胞能表达腺病毒活化的早期蛋白El和E3，重组质粒 pAdeno-X-HPV16， 18， 58mE67能够在HEK293细胞中进行包装并释放到培养基中，用 超高速离心机回收上述步骤一制备的重组腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67，然后用腺 病毒滴定试剂盒测定重组腺病毒的滴度。
三、 荧光显微镜观察
重组质粒pAdeno-X-HPV16, 18mE67-EGFP (其构建过程同 pAdeno-X-HPV16, 18， 58mE67，用EGFP取代重组质粒pAdeno-X-HPV16， 18， 58mE67中 的HPV58mE67基因)转染HEK293细胞48h后开始，定时观察HEK293细胞表达绿色 荧光的情况，估算HPV58mE67的表达强度。结果表明HPV58mE67在HEK293细胞中 能表达。
四、 Western blot检测
用上述步骤二纯化的感染复数(MOI)为5: l的重组腺病毒 rAd-HPV16， 18， 58mE67感染COS-7细胞， 一天后收集细胞，RIPA裂解细胞提取蛋白， 分别以小鼠抗人HPV16，18E6单抗(购自Chemicon公司)、HPV16E7单抗(购自 Neomarker公司)、HPV18E7单抗(购自GeneTex公司)和HPV58单抗(购自Santa Cruz 公司)为一抗，Western blot检测HPV16mE67、 HPV18mE67和HPV58mE67的表达。
Western blot检测结果如图4所示。其中，泳道1、 3、 5和7表示未转染腺病毒的C0S-7细胞的Western blot检测结果；泳道2、 4、 6和8分别表示转染重组腺 病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67的C0S-7细胞用不同抗体检测的Western blot检测结果。 结果表明HPV16mE67和HPV18raE67有较高的表达，但HPV58mE67的表达量较 HPV16mE67和HPV18mE67的表达量少，可能存在表达的极性问题。
实施例5、 S0CS1 shRNA的设计和重组表达载体RNAi-SOCSl-pShuttle和 RNAi-mS0CS1-pShuttle的构建
S0CS1 shRNA的设计登录上海吉玛生物公司网站进行，S0CS1 shRNA的一条链 为sh腿-S0CS1(F):
5 ， - m 7to:tacctgagttccttccccttcaagagaggggaaggmctcaggtagtttttt 6" -3'(自
5'末端第6位至第58位是序列表中序列9) ; S0CS1 shRNA的互补链为 shRNA-S0CS1(R):5' -W7TCAAAAAACTACCTGAGTTCCTTCCCCTCTCTTGAAGGGGAAGGAACTC AGGTAGf-3，(自5，末端第6位至第58位是序列表中序列10) ; mS0CSl shRNA 的一条链为shRNA-mS0CSl(F):
5 ， - W 7TaCTATCTAAGTTACTACCCCTTCAAGAGAGGGGTAGTAACTTAGATAGTTTTTTT 3 ，， mS0CSl shRNA的互补链为shRNA-mS0CSl (R):
5， -^7T6AAAAAAACTATCTMGTTACTACCCCTCTCTTGMGGGGTAGTAACTTAGATAGTg -3，， 中间画线部分为环序列，TTTTTT为转录终止区，再在每条链两端引入I和fco/ / 的粘性末端。
将合成的shRNA-S0CSl和shRNA-mS0CSl的正义链和反义链分别退火成为双链 DNA， 20pl复性反应体系为正义链lpl、反义链lpl、 20XSSC (sigma公司， Cat.S6639) l|il，水17pl。反应条件为95。C加热2min， 72°C 2min， 34°C 2min。 室温下冷却lh，分别稀释至终浓度为40ng/pl。上述shRNA-S0CS1编码的双链RNA 的正义链为5， -CUACCUGAGUUCCUUCCCC-3，(序列表中序列11)，反义链为5，-GGGGAAGGAACUCAGGUAG-3，(序列表中序列12)。
将上述稀释后的双链DNA (shRNA-S0CSl和shRNA-mS0CSl)分别与经限制性内切 酶5朋z^I和fcoy 7酶切的载体RNAi-Ready pSIREN-Shuttle (购自BD公司)用T4 DNA 连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，Amp抗性平板筛选阳 性克隆，摇菌，提质粒，^s/z^I和ibo/ 7双酶切及测序鉴定，将获得的序列及插入 位置均正确的含有抑制基因表达的小干扰RNA编码基因的重组RNAi载体分别命名为 RNAi-S0CSl-pShuttle和RNAi-mS0CS1-pShuttle。
19实施例6、重组腺病毒rAd-RNAi-S0CSl和rAd-RNAi-mSOCSl的构建 一、重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl和rAd-RNAi-mSOCSl的构建 将重组表达载体RNAi-SOCSl-pShuttle和RNAi-mSOCSl-pShuttle分别用PI-Sce I和I-Ceu I (购自BD Clontech公司)进行双酶切，回收酶切产物，用Takara ligation Mixture分别连入Adeno-X表达系统(购自BD Clontech公司)中的Adeno-X病毒 DNA中，置PCR仪中16r连接过夜。将连接产物用Swal酶切消化(Swal酶切位点 位于PI-SceI与I-CeuI之间)，以去除未能与Adeno-X病毒DNA连接的基因片段。 再次回收酶切产物，将shRNA-SOCSl与Adeno-X病毒DNA正确连接的重组腺病毒载 体命名为Adeno-X-RNAi-SOCSl ，将shRNA-mS0CSl与Adeno-X病毒DNA正确连接的 重组腺病毒载体命名为Adeno-X-RNAi-mSOCSl 。
用重组腺病毒载体Adeno-X-RNAi-SOCSl和Adeno-X-RNAi-mSOCSl分别转化大肠 杆菌DH5ct， A即抗性平板挑选阳性克隆。分别提取重组腺病毒载体 Adeno-X-RNAi-SOCSl和Adeno-X-RNAi-mSOCSl的DNA，将所得的重组质粒分别命名为 pAdeno-X-RNAi-SOCS1和pAdeno-X-RNAi-mSOCS 1 。对重组质粒pAdeno-X-RNAi-SOCS1 和pAdeno-X-RNAi-mSOCSl进行PCR扩增、酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组质粒送 上海博亚测序。Pac I酶切pAdeno-X-RNAi-SOCSl和pAdeno-X-RNAi-mSOCSl用于转染 服K293细胞。
用线性化后的重组质粒pAdeno-X-RNAi-SOCSl和pAdeno-X-RNAi-mSOCSl分别转 染HEK293细胞，培养转染后的细胞至细胞出现明显的病态效应(cytopathic effect, CPE)。
重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl和rAd-RNAi-mSOCSl的制备按照Adeno-X Expression System User Manual进行，具体过程如下
(1) 用PBS洗涤上述出现明显病态效应的HEK293细胞2次，直接将HEK293细 胞吹打下来(不用胰酶)，1,500rpm室温下离心5min; 500^1 PBS重悬细胞；
(2) -2(TC和37'C水浴反复冻融细胞3次，每次融化后短时间混匀细胞悬液；
(3) 12000rpm室温离心10min，收集含病毒的上清，加入10%甘油，过滤除菌后 作为重组病毒原液置-7(TC冻存备用；
(4) 培养HEK293细胞，待细胞铺满瓶底50-70%时，加入步骤(3)制备的病毒原 液250ul，继续培养；
(5) 观察细胞的病态效应，待50%以上的细胞从培养板底浮起时，重复上述(1)-(3)步骤制备重组腺病毒rAd-RNAi-S0CS1和rAd-RNAi-mS0CSl， -2(TC存放，以
备测定病毒滴度或进一步制备高滴度病毒用。
二、重组腺病毒rAd-RNAi-S0CS1和rAd-RNAi-mSOCSl的滴度测定 用超高速离心机回收上述步骤一制备的重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl和
rAd-RNAi-mSOCSl，然后用腺病毒滴定试剂盒测定重组腺病毒的滴度。结果表明，
重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl的滴度为2.8xlOVfu/ml，重组腺病毒rAd-siDNA-mSOCSl
的滴度为2. 5xl07pfu/ml。
实施例7、 RT-PCR分析DCs细胞中SOCSl的表达
将培养的DCs细胞(Evel-kabler K, Song XT, Aldrich M, Huang XF and Chen SY. SOCS1 restricts dendritic cell's ability to break self tolerance and induce antitumor immunity by regulating aIL-12 production and signaling丄Clin. Invest. 2006; 116: 90-100)简单地说，小鼠BM用灭菌的PBS冲洗其后肢的骨髓，用0.83%氯化铵除去 红细胞，然后用无血清的RPMI-1640洗三次，每次2分钟，低速离心5分钟，最后用 含血清的RPMI-1640在12孔板中培养，并且补充重组小鼠GM-CSF (20ng/ml;PeproTech)， IL-4 (20ng/ml;PeproTech)。在培养后的第二天和第四天， 弃去上清，换上含小鼠GM-CSF (20ng/ml;PeproTech)， IL-4 (20ng/ml; PeproTech) 的培养液继续培养。所有培养物均在37。C 5%湿化的0)2培养箱培养，未贴壁的粒细 胞在48小时后除去，补充新鲜的培养基。培养7天后，用FACS检测超过80%的细胞 表达DC-特异性的标记。)用PBS洗涤两次后，分别提取其总RNA，然后将其反转录 成cDNA并以此cDNA为模板，以S0CS1-F: 5， -CCAGCCCCTGGCGACACT-3'和S0CS1-R: TGCGGCGCGCGGCGCCGCCACG-3 ，为引物，进行实时定量PCR反应。以GADPH作为内参， 扩增GADPH的引物为GADPH-F: 5， -ATCACTGCCACCCAGAAGAC-3，和GADPH-R: 5' -ATGAGGTCCACCACCCTGTT-3'。同时用不含反转录酶的样品作为对照，以确保RNA 中不含DNA。
以不同感染复数(M0I)的重组腺病毒rAd-RNAi-S0CSl和rAd-RNAi-mS0CSl分别 感染培养的DCs细胞，以检测不同MOI的重组腺病毒使DCs细胞中的SOCSl的表达受到 抑制的情况。结果如图7A所示。其中，泳道l为未感染重组腺病毒的DCs细胞中SOCSl 的表达，泳道2为感染复数(M0I)为100的重组腺病毒rAd-RNAi-mS0CSl感染DCs细 胞48h后S0CSl的表达，泳道3为感染复数(M0I)为50的重组腺病毒rAd-RNAi-S0CSl 感染DCs细胞48h后S0CSl的表达，泳道4为感染复数(MOI)为100的重组腺病毒rAd-RNAi-S0CSl感染DCs细胞48h后S0CSl的表达。上述各组细胞中mRNA的相对比例
(参照GADPH)如图7B所示。结果表明，当M0I为100时，感染重组腺病毒 rAd-RNAi-SOCSl的DCs细胞中SOCSl的表达受抑制现象最明显，而用不同MOI的重组 腺病毒rAd-RNAi-mSOCSl感染的DCs细胞中SOCSl的表达则没有明显的变化，表明重 组腺病毒rAd-RNAi-mSOCSl不能抑制DCs细胞中SOCSl的表达。
重组腺病毒感染DCs细胞两天后，细胞的形态如图5所示。其中，A为未感染病 毒的DCs细胞，B为感染重组腺病毒rAd-RNAi-mSOCSl的DCs细胞，C为感染重组腺病 毒rAd-RNAi-SOCSl的DCs细胞，D为图A中的一个细胞，形态清楚，具有典型的DCs特 征。结果表明，由于腺病毒为复制缺陷型腺病毒，所以用该复制缺陷型腺病毒制备 的重组腺病毒感染DCs细胞2天后未出现细胞病变，可以作为修饰的树突状细胞使 用。
实施例8、重组腺病毒感染DCs细胞及DCs细胞的成熟
将400ul DCs细胞以lXl()6个细胞/孔的量接种在12孔培养板中。将M0I为100的重 组腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-S0CSl以l: l的体积比混合后感染上述 DCs细胞，将M0I为100的重组腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67和rAd-RNAi-mSOCSl以l: l的体积比混合后感染上述DCs细胞。感染8-12小时后，用PBS洗涤细胞2-3次，然后 在含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4 (IL-4)的 RPMI-1640完全培养基上继续培养，用100ng/ml的LPS刺激上述细胞24h后用PBS洗3 次，然后将转入重组腺病毒rAd-HPV16, 18，58mE67和rAd-RNAi-SOCSl的DCs细胞，转 入重组腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-mSOCSl的DCs细胞分别稀释成浓度 为lX104个细胞/200ul，准备回输到小鼠体内。
实施例9、动物实验
雌性C57BL/6(H-2b)小鼠，周龄为3-5周，购自广州中医药大学实验动物中心， 在无特殊病原体的笼子里喂养。 一、抑制肿瘤生长
将培养的TC-1细胞(上海肯强生物仪器有限公司)用PBS洗3次后，调整细胞密 度为lX107ml，每只小鼠皮下接种200ul上述TC-l细胞，接种12天后，用手能触摸 到肿瘤，估计肿瘤的直径大小为125ram。将已成瘤的小鼠随机分成注射未感染重组腺 病毒的DCs细胞组(g卩PBS组)、注射感染重组腺病毒rAd-HPV16, 18, 58mE67和 rAd-RNAi-SOCSl的DCs细胞组、注射感染重组腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-mSOCSl的DCs细胞组，每组10只小鼠。PBS组每只小鼠从后脚垫注射O. 2ml 用PBS稀释的lX104个成熟的DCs细胞；注射感染重组腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和 rAd-RNAi-SOCSl的DCs细胞组，每只小鼠从后脚垫注射O. 2ml 1X1(T个感染了重组腺 病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-SOCSl的成熟的DCs细胞；注射感染重组腺病 毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-mSOCSl的DCs细胞组，每只小鼠从后脚垫注射 0. 2ml 1Xl()4个感染了重组腺病毒rAd-HPV16， 18, 58mE67和rAd-RNAi-mSOCSl的成熟的 DCs细胞。7天后在上述各组小鼠的腹膜内注射5昭LPS (Sigma公司)，观察小鼠的 肿瘤生长情况。
每周免疫上述各组小鼠一次，连续免疫2周，每两天用游标卡尺测量肿瘤的长 和宽并统计小鼠的存活率，肿瘤体积的大小按照宽2X长/2计算。当肿瘤大小达到 2500mm3时，断颈处死小鼠。小鼠的存活率结果如图7所示。结果表明PBS组小鼠 在18-24天内肿瘤大小达到2500mm、注射感染重组腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和 rAd-RNAi-mSOCSl的DCs细胞组的小鼠，在52-64天内肿瘤大小达到2500mm、注射感 染重组腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-S0CSl的DCs细胞组的小鼠肿瘤未 见明显生长，从第一次免疫起22天内，60%的小鼠触摸不到肿瘤。以上结果说明， 注射感染重组腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67和rAd-RNAi-S0CSl的DCs细胞组的小鼠 肿瘤生长明显被抑制。
二、 CTL反应
将上述步骤一的成瘤小鼠随机分成PBS组、注射感染重组腺病毒 rAd-HPV16,18, 58mE67和rAd-RNAi-S0CS1的DCs细胞组、注射感染重组腺病毒 rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-mSOCSl的DCs细胞组，每组10只小鼠，每周免 疫上述各组小鼠一次，连续免疫2周，各组的免疫原和免疫剂量均同步骤一。当肿 瘤大小达到2500mm3时，断颈处死小鼠并取其脾细胞作CTL反应。具体的实验过程 如下
将各组小鼠脾的单细胞悬浮培养在RPMI1640 (GIBCO/BRL)中，补充10%FCS、 2mM L-谷氨酰胺、lmM丙酮酸钠(GIBCO/BRL)、 50MM 2-巯基乙醇和50l^g/ml的硫酸 庆大霉素(GIBCO/BRL)。用1 pg/ml合成多肽E7.49-57 (上海生工生物工程技术服务 有限公司)分别刺激上述各组小鼠脾的单细胞7天，7天后分析各组细胞的裂解活 性。以激活的脾细胞作为效应细胞，以TC-1细胞作为靶细胞，将上述效应细胞和 靶细胞按照100:1、 33:1和11:1的体积比混合并接种到96孔板中，混合细胞在37°C条件下5% C02培养箱中培养4小时，然后用离心机((Beckman Coulter Canada, Mississauga, ON)以200xg离心5min。从每个孔收集lOOul培养上清，用试剂盒检 测乳酸脱氢酶(LDH)的活性。为了检测自发的LDH活性，设培养孔中只有靶细胞 没有效应细胞作为对照，检测最大释放的乳酸脱氢酶(LDH)的活性。培养孔中加 Triton X-100 (1%质量百分含量)表示最大释放活性。乳酸脱氢酶活性的计算公式为 (LDHtest—LDHspont)/(LDH total _LDHspont)] x 100 (Shan, B.E., J.S. Hao, Q.X.. Li, and M.Tagawa. Antitumor Activity and Immune Enhancement of Murine Interleukin-23 Expressed in Murine Colon Carcinoma Cells Ce/Mar <fe My/ecw/ar /mmt/wo/ogy. 2006; 3(1), 47-52)。公式中LDH^、 LDHs,和LDH舰分别代表试验孔、自发释放孔和 最大释放孔。实验设三次重复，具体结果如图8所示。注射感染重组腺病毒 rAd-HPV16, 18, 58mE67和rAd-RNAi-S0CSl的DCs细胞组、注射感染重组腺病毒 rAd-HPV16, 18， 58mE67和rAd-RNAi-mS0CSl的DCs细胞组效应细胞对耙细胞的裂解 率分别达81%和67%，而PBS组不到30。/。。结果表明，注射感染重组腺病毒 rAd-HPV16, 18， 58raE67和rAd-RNAi-S0CS1的DCs细胞组能产生强烈的CTL反应。
由于IL-12受到S0CS1的调控，因此IL-12被称作是NK细胞刺激因子或细胞毒淋 巴细胞成熟因子，是介导先天免疫及细胞免疫的重要细胞因子，具有强大的抗肿瘤 及抗转移活性。目前，IL-12用于肿瘤和传染性疾病治疗的II期临床试验。IL-12在 体外对于肿瘤细胞并没有直接的作用，但能激活T细胞及NK细胞，剌激CD4+T细胞向 Thl表型分化，Thl细胞产生的细胞因子可激活CTL和巨噬细胞。IL-12是血管形成的 强力抑制剂，通过诱导IFN-Y分泌以及产生IP10而抑制血管形成，进而抑制体内肿 瘤生长。用IL-12检测试剂盒(购自eBioscience公司)检测上述各组小鼠血清中IL-12 的p40亚单位，结果如图10所示。结果表明，注射感染重组腺病毒 rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-S0CSl的DCs细胞组小鼠血清中IL-12的浓度最高， 与其他组相比具有显著性差异(p<0.05)。
三、ELISPOT分析抗原特异的T细胞
用ELISP0T试剂盒(购自eBioscience公司)检测从被免疫的小鼠脾中收集的激活 的抗原特异的细胞毒T细胞。具体实验过程如下
用纯化的抗小鼠IFN-Y抗体(购自eBioscience公司)包被96孔硝酸纤维板， 4"C孵育过夜，然后用RMPI-1640完全培养基封闭。加入100iU含l(f个上述步骤 二获得的各组小鼠脾细胞到96孔板中，细胞作系列稀释(10倍稀释)，用lug/ml的E7. 49-57或R187多肽(上海生工生物工程技术服务有限公司)刺激或不刺激上 述各组脾细胞(RAHYNIVTF对应于HPV16E7氨基酸的49-57， Rl87(FLLTRILTI) 对应于HbsAgaal83-191)。用PMA(5ng/ral， Sigma公司)作为阳性对照，用R187 或培养基作为阴性对照。培养板在37。C条件下02培养箱中孵育过夜。第二天用 检测抗体(生物素标记的抗小鼠IFN-y抗体)(购自eBioscience公司，试剂盒已 提供)在室温下孵育2小时，洗掉没有结合的抗体；再加入Streptavidin-服P (购自 eBioscience公司，试剂盒已提供)，室温下孵育1小时，洗去没有结合的检测酶复 合物。培养板用AEC底物染色20分钟，空气中干燥过夜，用放大镜对染色点计数， 产IFN-y脾细胞的染色结果如图9A所示(左图为阴性对照组，右图为实验组)， ELISPOT试剂盒分析各组DCs细胞中IFN-y的表达结果如图9B所示。结果表明， 注射感染重组腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67和rAd-RNAi-S0CS1的DCs细胞组、注 射感染重组腺病毒rAd-HPV16， 18, 58mE67和rAd-RNAi-mSOCSl的DCs细胞组均能产 生IFN-y的T细胞。序列表
<160> 12
<210> 1
<211〉 777
<212> DNA 〈213>人工序列
〈400〉 1
atgcaccaaaagagaactgcaatgtttcag gacccacaggagcgacccagaaagttacca60
catttatgcacagagctgcaaacaactata catga/tataatatt6igaatgtgtgtactgc120
aagcaacagttactgcgacgtgaggtatat gactttgcttttcgggatggttgcatagta180
tatagagatgggaatccatatgcagtgtgt gataaatgtttaaagttttattctaaaatt240
agtgagtatag3tstt3ttgttatagtgtg tatggaacaacattagaacagcaa_tacaa_c300
aaaccgttgtgtgatttgttaattaggggt attaactgtcaaaagccactgtgtcctg朋360
ga^a_a_gca_aagacatctggacaaaaagcaa agattccataatataaggggtcggtggacc420
ggtcgatgtatgtcttgttgcagatcatca agaacccgtagagaaacccagctg8agctt480
atgcatggagatacacctacattgcatgaa tatatgttagatttgcaaccagagacaact540
gatggctactgttatgagcaattaaatgac agctcagagg3gga卿tgaaatagatggt600
CC3gCtgg3C犯gcagaaccggacagagcc cattacaatattgtaaccttttgttgcaag660
tgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaa agcacacacgtagacattcgtactttggaa720
gscctgttaatgggca_ca_ctaggaattgtg gggcccatctgttctcagaaaccataa777
〈210〉 2
〈211〉 798
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
〈400〉 2
26atggcgcgctttgaggatcc aacacggcga ccctacaagc tacctgatctgtgC3Cgg3360
ctgaacacttcactgcaaga catagaaata acctgtgtat attgcaagacagtattggaa120
cttscag3ggtatttgaatt tgcatttaaa gatggatttg tagtgtatagagacagtata180
ccgcatgctgcatgccataa aggtatagat ttctattcta gaattagaga3ttaagatat240
tattcagactctgtgtatgg agacacatta gaaaaactaa ctaacactgggttatacaat300
ttattaataaggtgcctgcg gtgccagaaa ccgttgaatc ca.gcagaaaaacttagacac360
cttaa_tgaa_aaacgacgatt ccacaaaata gctgggcact atagaggccagtgccattcg420
tgctgcaaccgagcacgaca ggagagactc caacgacgca gagaaacacaagtagtcgac480
atgtatggacctaaggcaac attgcaagac attgtattgc atttagagcctcaaaatgaa540
attccggttgaccttctagg tcacgagcaa ttaagcgact cagaggaagaaaacgatgaa600
atagatggagttaatcatca acatttacca gcccgacgag ccgaaccacaacgtcacaca660
atgttgtgtatgtgttgtaa gtgtgaagcc agaattgagc tagtagtagaaagctcagca720
gacgaccttcgagcattcca gcagctgttt ctgagcaccc tgtcctttgtgggtccgtgg780
tgtgcatccc agcagtaa798
<210〉 3
〈211〉 750
<212〉 腿
<213>人工序列
<400> 3
atgttccaggacgcagagga gaaaccacgg acattgcatg atttgtgtcaggcgttggag60
acatctgtgcatga犯tcga attg肌atgc gttgaatgcei gia犯geictttgcsgcgatct120
g鄉t3t3tgactttgtatt tgcagatggc agaatagtgt atagagatggaaatccattt180
gcEigteitgt3aagtgggctt acgattgcta tctaaaataa'gtgagtatag240
tattcgctat9"tggagacac att3gaacaa ac3ctaaaa3 3gtgttta_aatgaaatatt8L300
attagatgtattatttgtca aa_gacca_ttg tgtccacaag a_aaa_a3aaaggcatgtggat360
ggtttcataa tatttcgggt cgttggeicag ggcgctgtgcagtgtgttgg420
agaccccgacgtag8CEi犯c acaagtgg肌ttcatgag3g ga犯c3accc犯cgctaagei480
gaatatattttagatttaca tcctgaacca actgacctat tctgctacggccaattatgt540
g8C3gCtC3gacgaggatga aataggcttg gacgggccag atggacaagcacaaccggcc600
acagctaattactacattgt aacttgttgt tacacttgtg gcaccacggttcgtttgtgt660
caacaaccga cgtacgaacc ctacagcagc tgcttatgggcacatgtacc720attgtgggcc ctagctgtgc acagcaataa
<210> 4
〈211〉 663
〈212> DNA <213>人工序列
〈400〉 4
gatccgcccc tctccctccc ccccccctaa ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc acc
<210> 5 〈211〉 3676 〈212> DNA <213〉人工序列
<400〉 5
tctagaatgc eiccaaaagag aactgcaatg ttaccacatt tatgcacaga gctgcaaaca tactgcaagc aacagttact gcgacgtgag atagtatata gagatgggaa tccatatgca aaaattagtg agtatagata ttattgttat
750
cgttactggc cgaagccgcttggaataagg60
caccatattg ccgtcttttggcaatgtg3g120
gagcattcct aggggtctttcccctctcgc180
gaaggaagca gttcctctggaagcttcttg240
caggcagcgg aaccccccacctggcgacag300
agatacacct gc3朋ggcggC3C3aCCCC3360
aagagtcaaa tggctctcctcaagcgtatt420
accccattgt atgggatctgatctggggcc480
gaggttaai犯eiaeicgtctagatgggatctg540
gtgtttagtc gaggttaaaaaaacgtctag600
tttgaaaaac acgatgataatatggccaca660
663
tttc8Lggacc C3caggagcgeicccagaasg60
actataceitg atataatattagaatgtgtg120
gtatatgact ttgcttttcgggatggttgc180
gtgtgtgata aatgttt肌agttttattct240
agtgtgtatg gaacaacatt300t ac aac aaaccgttgtgtgatttgttaatt8ggggtatt3actgtcaaaagccactgtgt360
cctgaagaaaagcaaagacatCtgg3C犯8aagcaaagattccataatataaggggtcgg420
tggaccggtcgatgtatgtcttgttgcagatcatcaagaacccgtagagaaacccagctg■
aagcttatgcatggagatacacctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagag540
acaactgatggctactgttatgagcaattaaatgacagctca_gaggaggaagatgaaata600
g3tggtCC3gctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatattgtaaccttttgt660
tgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacattcgtact720
ttgg肌gacctgtt肌tgggcacactaggaattgtggggcccatctgttctcagaaacca780
taaggatccttacctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaat840
肌ggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatg■
tgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctc960
tcgcc肌sggaatgc犯ggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagctt1020
cttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcg1080
acaggtgcctctgcggccaa犯gCC3CgtgtataagatacacctgcaaeiggCggC3C犯C1140
cccagtgccacgttgtgagttggatagUgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcg1200
tattcaacaaggggctgaaggatgcccaga3ggt3ccccattgtatgggatctgatctgg1260
ggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaa3a3aacgtCt,tggg31320
tctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggtta^a^aaa^cgt1380
ctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaeiacacgatgataatatggc1440
caccgaattcatggcgcgctttgaggatccaacacggcgaccctacaagctacctgatct1500
gtgcacgg犯ctgaacacttcactgcaagacatagaaataacctgtgtatattgcaagac1560
agtattggeieicttacagaggtatttgaatttgcatttaaagatggatttgtagtgtatag1620
agacagtataccgcatgctgcatgccataa3ggt3t8geitttctattctagaattagaga1680
attaagatattattcagactctgtgtatggagacacattagaa^aactaactaacactgg1740
gtt3ta_caa_t11 at t aat aaggtgcctgcggtgccagaaaccgttgaatccagcagaaeia1800
acttag3C3Ccttaatgsaaaacgeicggittccacaaaatagctgggcactatagaggcca1860
gtgccattcgtgctgcaaccg￡lgCa_Cg￡lC3gg,gactccaacgacgcaga_ga￡iacac31920
agtagtcgacatgtatggacctaaggcaacattgcaagacattgtattgcatttagagcc1980
tcaaaatgaaattccggttgaccttctaggtcacgagcaattaagcgactcagagg犯ga2040
aaacgatgaaat卿tggagttaatcatcaacatttaccagcccgacgagccgaaccaca2100
acgtcacacaatgttgtgtatgtgttgtaagtgtgaagccagaattgagctagtagtaga2160
aagctcsgc3gacgaccttcgagc3ttcc3gcagctgtttctgagcaccctgtcctttgt2220
gggtccgtggtgtgcatcccagcagtaaggatccttacctctccctcccccccccct肌c2280
gttactggccgaagccgcttgg犯t犯ggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttcc2340
accatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacg2400
agcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggeiatgcaeiggtctgttgaatgtcgtg2460
肌gg卿C3gttcctctggaagcttcttgacgtctgtagcgaccctttgc2520aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa 2580
gatacacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa 2640
agagtcaaat ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta 2700
ccccattgta tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gcttteicatg tgtttagtcg 2760
aggttaaaaa aacgtctaga tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gctttacatg 2820
tgtttagtcg aggttaaaaa aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg tggttttcct 2880
ttgaaaaaca cgatgataat atggccacac tcgagatgtt ccaggacgca gaggagaaac 2940
cacggacatt gcatgatttg tgtcaggcgt tggagacatc tgtgcatgaa atcgaattga 3000
aatgcgttga atgcaaaaag actttgcagc gatctgaggt atatgacttt gtatttgcag 3060
atggcagaat agtgtataga gatggaaatc catttgcagt atgtaaagtg ggcttacgat 3120
tgctatctaa aataagtgag tatagacatt ataattattc gctatatgga gacacattag 3180
aacaaacact aaaaaagtgt ttaaatgaaa tattaattag atgtattatt tgtcaaagac 3240
cattgtgtcc acaagaaaaa aaaaggcatg tggatttaaa caaaaggttt cataatattt 3300
cgggtcgttg gacagggcgc tgtgcagtgt gttggagacc ccgacgtaga caaacacaag 3360
tggaattcat gagaggaaac aacccaacgc taagagaata tattttagett ttacatcctg 3420
aaccaactga cctattctgc tacggccaat tatgtgacag ctcagacgag gatgaaatag 3480
gcttggacgg gccagatgga caagcacaac cggccacagc taattactac attgtaactt 3540
gttgttacac ttgtggcacc acggttcgtt tgtgtatcaa cagtacaaca accgacgtac 3600
gaaccctaca gcagctgctt atgggcacat gtaccattgt gggccctagc tgtgcacagc 兆60
aataaacagc ggccgc 3676
<210〉 6
<211> 258
〈212〉 PRT 〈213〉人工序列
〈400〉 6
Met His Gin Lys
1
Arg Lys Leu Pro 20
lie lie Leu Glu 35
Val Tyr Asp Phe
Arg Thr Ala Met Phe Gin Asp Pro Gin Glu Arg Pro
5 10 15
His Leu Cys Thr Glu Leu Gin Thr Thr lie His Asp
25 30 Cys Val Tyr Cys Lys Gin Gin Leu Leu Arg Arg Glu
40 45 Ala Phe Arg Asp Gly Cys lie Val Tyr Arg Asp Gly
30Asn
65
Ser
Cys
Lys
Ser 145 Met
Arg
50 Pro
Tyr Ala Val Glu Tyr Gin Gin Tyr
Gin
Gin 130 Cys
His
Arg Tyr
85 Asn Lys 100
Pro Leu
Cys
70
Tyr
55 Asp
Lys Cys Leu Cys Tyr Ser Pro Leu Cys
Lys 115
Arg Phe His Cys Arg Ser Gly
Cys Asn
Pro
lie 135 Arg
Glu 120
Arg
Thr
Asp 105 Glu
Gly
Arg
Val
90
Leu
Ser 150
Pro Thr Leu His
Asp Thr 165
Pro Glu Thr Thr Asp Gly Tyr Cys 180
Asp Glu lie
Glu Glu Glu 195 His
Tyr Asp
Ala 210 Arg
Leu
Leu 225
Asp Leu Leu Lys Pro
Tyr Asn
Cys Val
Met Gly 245
lie
Gly 200 Thr
Lys Arg Arg
Lys
75
Tyr
Leu
Gin
Trp
60
Phe Tyr Ser Lys
Gly Thr Thr lie Arg Arg
Thr 140 Thr
His 125 Gly
Glu 170
Glu Gin Leu Asn
Tyr 185
Pro Ala Gly Gin
Phe
Val 215
Gin Ser Thr His 230
Thr Leu Gly lie
Cys
Val
Val 250
Gly Cys
Gly 110 Leu
Leu
95
lie
Asp Arg Cys Gin Leu Lys
Glu 155
Tyr Met Leu Asp
Leu 175 Ser
Lys 220
lie Arg Thr Leu
Asp 235
Gly Pro lie Cys
Ser 255
lie
80
Glu
Asn
Lys
Met
Leu 160 Gin
Ser
Asp 190
Glu Pro Asp
Ala 205
Cys Asp Ser Thr
Glu 240 Gin
〈210〉 7 <211> 265 〈212〉 PRT〈213>人工序列
〈400> 7 Met Ala Arg
1
Leu
Phe Glu Asp Pro Thr Arg 5
Cys Thr
Val Tyr
Phe
Cys
65
Tyr
Lys
50
His
Cys
35
Asp
Glu
20
Lys
Ser Asp Ser
Gly Leu Tyr
Asn Pro
Lys
Ala 145 Met
lie 130 Arg
Ala 115 Ala
Asn 100 Glu
Pro Gin Asn
Glu 180
Leu
Lys Gly lie
Val
85
Leu
Tyr Gly Pro
Lys 165 lie
Asn Thr Ser
Thr Val Leu
Gly Phe Val
Asp
70
Tyr
Val
55
Phe
Lys Leu Arg
Gly His Tyr
Gin Glu Arg
Leu 150 Ala
Arg 135 Gin
Glu
40
Tyr
His 120 Gly
Leu
25
Leu
Tyr Ser
Gly Asp Thr
Leu lie Arg
Cys 105 Leu
Thr Leu Gin
Pro Val Asp
Leu 185
Arg Pro 10
Gin Asp Thr Glu
Arg Asp Ser
Arg lie
75 Leu Glu 90
Leu Arg Asn Glu
Gin Cys His
Arg Arg
Arg Glu 155 Asp lie 170
Leu Gly
Tyr Lys Leu Pro Asp 15
lie Glu lie Thr Cys 30
Val Phe Glu Phe Ala 45
lie Pro His Ala Ala 60
Arg Glu Leu
Lys Leu Thr
Cys Gin Lys 110
Lys Arg Arg
125 Ser Cys Cys 140
Thr Gin Val
Val Leu His
His Glu Gin 190
Asn
95
Pro
Tyr 80 Thr
Leu
Phe His
Asn Arg
Val
Leu 175 Leu
Asp 160 Glu
SerAsp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu lie Asp Gly Val Asn His Gin His
195 200 205
Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gin Arg His Thr Met Leu Cys Met
210 215 220
Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg lie Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala 225 230 235 240
Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gin Gin Leu Phe Leu Ser Thr Leu Ser Phe
245 250 255
Val Gly Pro Trp Cys Ala Ser Gin Gin 260 265
〈210〉 8
〈211〉 249
〈212〉 PRT <213>人工序列
〈400〉 8
Met Phe Gin Asp Ala Glu Glu Lys Pro Arg Thr Leu His Asp Leu Cys
15 10 15
Gin Ala Leu Glu Thr Ser Val His Glu lie Glu Leu Lys Cys Val Glu
20 25 30
Cys Lys Lys Thr Leu Gin Arg Ser Glu Val Tyr Asp Phe Val Phe Ala
35 40 45
Asp Gly Arg lie Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Phe Ala Val Cys Lys
50 55 60
Val Gly Leu Arg Leu Leu Ser Lys lie Ser Glu Tyr Arg His Tyr Asn 65 70 75 80
Tyr Ser Leu Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Gin Thr Leu Lys Lys Cys Leu 85 90 95Asn Glu lie Leu lie Arg Cys lie lie Cys Gin Arg Pro Leu Cys Pro
100 105 110
Gin Glu Lys Lys Arg His Val Asp Leu Asn Lys Arg Phe His Asn lie
115 120 125
Ser Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Ala Val Cys Trp Arg Pro Arg Arg
130 135 140
Arg Gin Thr Gin Val Glu Phe Met Arg Gly Asn Asn Pro Thr Leu Arg 145 150 155 160
Glu Tyr lie Leu Asp Leu His Pro Glu Pro Thr Asp Leu Phe Cys Tyr
165 170 175
Gly Gin Leu Cys Asp Ser Ser Asp Glu Asp Glu lie Gly Leu Asp Gly
180 185 190
Pro Asp Gly Gin Ala Gin Pro Ala Thr Ala Asn Tyr Tyr lie Val Thr
195 200 205
Cys Cys Tyr Thr Cys Gly Thr Thr Val Arg Leu Cys lie Asn Ser Thr
210 215 220
Thr Thr Asp Val Arg Thr Leu Gin Gin Leu Leu Met Gly Thr Cys Thr 225 230 235 240
lie Val Gly Pro Ser Cys Ala Gin Gin 245
〈210〉 9 〈211> 53 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<400> 9
ctacctgagt tccttcccct tcaagagagg ggaaggaact caggtagttt ttt 53 <210> 10〈211> 53
〈212> DNA <213>人工序列
<400> 10
aaaaaactac ctgagttcct tcccctctct tgaaggggaa ggaactcagg tag 53
<210〉 11
<211> 19
<212> RNA <213>人工序列
〈400〉 11
CU3CCUg3gU uccuucccc 19
<210〉 12
<211〉 19
〈212〉 RNA 〈213>人工序列
<400〉 12
ggggaaggaa cucaggimg 19
权利要求
1、表达如下双链RNA的复制缺陷型重组腺病毒，所述双链RNA的正义链的序列如序列表中序列11所示；所述双链RNA的反义链的序列如序列表中序列12所示。
2、 根据权利要求1所述的复制缺陷型重组腺病毒，其特征在于所述双链RNA 的编码shRNA的一条链的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列9所示，所述双链RNA 的编码shRNA的互补链的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列IO所示。
3、 根据权利要求1或2所述的复制缺陷型重组腺病毒，其特征在于所述复 制缺陷型重组腺病毒是用Adeno-X表达系统制备得到的。
4、 根据权利要求3所述的复制缺陷型重组腺病毒，其特征在于所述复制缺 陷型重组腺病毒按照如下方法制备1) 将所述双链RNA的编码DNA插入Adeno-X表达系统的 RNAi-Ready-pSIREN-shuttle的多克隆位点，得到重组表达载体 RNAi-SOCSl-pShuttle;2) 用PI-Sce I与I-Ceu I双酶切所述重组表达载体RNAi-SOCSl-pShuttle,将得 到的含有所述双链RNA的编码DNA的酶切片段与Adeno-X表达系统的Adeno-X病毒 DNA连接，将得到的连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，得到重组腺病毒DNA， 再将该重组腺病毒DNA转染HEK293细胞，得到复制缺陷型重组腺病毒 rAd-RNAi-SOCSl。
5、 一种修饰的树突状细胞，是将复制缺陷型重组腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67 和权利要求1-4中任一所述的复制缺陷型重组腺病毒感染树突状细胞中得到的；所述重组腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67是将转录融合三基因片段插入复制缺陷 型腺病毒表达载体得到重组腺病毒载体，再将该重组腺病毒载体导入细胞中得到重 组腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67;所述转录融合三基因片段包括HPV16mE67、 HPV18mE67和HPV58mE67以及连接 三者的短核苷酸片段；所述HPV16mE67编码的氨基酸序列是序列表中序列6;所述HPV18mE67编码的氨基酸序列是序列表中序列7;所述HPV58mE67编码的氨基酸序列是序列表中序列8;所述连接HPV16mE67、 HPV18mE67和HPV58mE67的短核苷酸片段为核糖体内部进入位点。
6、 根据权利要求5所述的修饰的树突状细胞，其特征在于所述HPV16mE67 的脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列1;所述HPV18mE67的脱氧核糖核苷酸序列 为序列表中序列2;所述HPV58mE67的脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列3;所 述核糖体内部进入位点的脱氧核糖核苷酸序列是序列表中序列4。
7、 根据权利要求6所述的修饰的树突状细胞，其特征在于所述转录融合三基 因片段的脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列5。
8、 一种治疗人宫颈癌的修饰的树突状细胞疫苗，它的活性成分是权利要求5-7 中任一所述的修饰的树突状细胞细胞。
9、 含有权利要求5-7中任一所述的复制缺陷型重组腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和权利要求1-4中任一所述的复制缺陷型重组腺病毒的重组 菌。
10、 权利要求5-7中任一所述的修饰的树突状细胞或权利要求9所述的重组菌 在制备预防和/或治疗人宫颈癌疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种治疗人宫颈癌的树突状细胞疫苗。本发明疫苗的活性成分是修饰的树突状细胞；所述修饰的树突状细胞是将复制缺陷型重组腺病毒rAd-HPV16，18，58mE67和复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1转入树突状细胞中得到的。本发明的树突状细胞疫苗不需要多肽或蛋白质的脉冲，避免了在脉冲过程中加入RNA而导致的降解。然后用LPS使树突状细胞成熟并回输体内，对荷瘤的个体产生强烈的免疫反应，突破机体对肿瘤细胞或病毒感染细胞的免疫耐受，在小鼠肿瘤模型的治疗性实验中，具有良好的治疗效果。
文档编号A61K39/00GK101591646SQ20081011301
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月27日 优先权日2008年5月27日
发明者骏 万, 师超凡, 张宏玲, 张毅娟, 义 郑, 黄来强 申请人:清华大学深圳研究生院