高压均质和酶解法联用提取猴头菇多糖的方法与流程

1.本发明属于中药技术领域，尤其涉及一种高压均质和酶解法联用提取猴头菇多糖的方法。


背景技术：

2.猴头菇(hericium erinaceus)是一种常见于阔叶树干断面或树洞中的大型肉质菌,成熟后变为黄棕色,呈毛茸状,极似毛猴的脑袋,是一种名贵的药食同源真菌。大量研究结果显示,猴头菇提取物营养丰富,功效显著,因而可成为各类保健品、功能性食品的添加原料,猴头菇化学成分众多,其中多糖被认为是猴头菇具有多种药理活性的物质基础之一。猴头菇多糖具有抗氧化、保护消化道黏膜、免疫调节等功能。猴头菇多糖主要是由葡萄糖、甘露糖和半乳糖等重要成分构成的葡聚糖，是β-1,3键连接的主链和β-1,6键连接的支链构成的基本结构。在医药和保健食品领域有广泛应用,猴头菇多糖的提取方法具有重要意义。
3.近年来，提取猴头菇多糖主要通过热水浸提法、酶解法、微波提取法、超声波提取法、微波协同复合酶法等方法。传统热水浸提法耗时长且提取率较低，微波提取的发挥热效应作用提高多糖的提取，但热水浸提和微波提取多糖均因高温条件而对猴头菇多糖造成损害。而超声波由于发挥其强烈的空化和搅拌作用等可以有效加速猴头菇多糖的多糖溶于溶剂中，但其只能对猴头菇粉的表面发挥作用，对其粉末内部多糖不能起到作用。酶解法提取温度低，能够防止猴头菇多糖的结构被长时间的高温作用毁坏，若酶解法与其他低温高效的提取方法结合将大大提高猴头菇多糖的提取率。
4.酶技术是近年来广泛应用到有效成分提取的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可以降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。同时，酶法提取可催化多糖分子内糖苷键断裂，降低多糖分子质量和分子黏度，提高多糖提取率和多糖活性利用率，同时缩短提取时间，降低提取成本。由于酶制剂的安全，高效，被广泛应用于食用菌的功能活性物质的提取。酶解法是多糖降解的一种常见方法，主要通过改变分子的结构特征来提高其生物活性，具有专一性强、高效性、降解条件温和等优点。
5.高压均质是利用柱塞泵为动力传递和输送液体物料的管道，柱塞泵吸入液体物料后并对液体物料加压，在柱塞作用下液体物料以高压低流速的状态进入压力可调节的均质阀中，液体物料在高压的作用下迅速通过特定宽度的均质阀缝隙，瞬间失压的液体物料以极高的流速(1000～1500m/s)碰撞在撞击环上，产生了剪切、空穴和撞击等机械力作用。
6.高压均质(high pressure homogenization，hph)通过高频振荡、高速剪切、空穴、瞬时高压和瞬时低压等综合效应，将液体中颗粒粉碎至平均直径《1μm,极大地增加了溶剂的穿透能力；同时，高压均质处理能够破坏细胞壁的结构，减少溶质扩散的阻力，从而加速可溶物的渗透和扩散，提高了目标产物的得率。高压均质的高速剪切可以使多糖的糖苷键断裂，降低多糖分子质量，提高多糖提取率和利用率。在压力范围80mpa到110mpa之间，高压均质压力对酶的活性影响不显著。
7.首先，与传统的多糖提取相比，hph集超声、超高压、回流提取等效果于一体，能更
高效的提取多糖；并且hph设备简单、耗能低、用时短的优点。同时，hph是一种非加热型的技术，工作温度低，有效避免因为热反应造成有效成分的结构变性、降解；并且仪器与外界的热交换作用良好，能够维持容器内温度的稳定，为酶法提取猴头菇多糖创造良好的反应条件。高压均质技术-酶解法联用能协同提高猴头菇多糖的提取效率。目前还未见高压均质技术-酶解法联用提取猴头菇多糖的相关报道。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于克服现有技术的不足，适应现实需要，提供一种高压均质和酶解法联用提取猴头菇多糖的方法，采用本发明提取工艺能够获得高提取率猴头菇多糖，且该工艺简便可行，为其相关制剂开发和应用奠定了基础。
9.为了实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案为：
10.本发明提供一种高压均质和酶解法联用提取猴头菇多糖的方法，包括以下步骤：
11.步骤1)：取干燥的猴头菇子，粉碎，过筛(80目)，加入蒸馏水，搅拌均匀，加入复合酶，用磷酸盐缓冲液调节ph至4
±
0.5，得溶液a；
12.步骤2)：将溶液a倒入高压均质设备的容器内进行高压均质提取，均质至少一次；
13.步骤3)：将均质机的压力升高后终止酶解反应，高压灭酶活，提取液经离心机离心后取上清液，旋转浓缩，加入乙醇，低温静置，离心，取沉淀，真空冷冻干燥得猴头菇多糖提取物。
14.步骤1)中，所述猴头菇子与蒸馏水的料液比为：w:v＝1:5-1:40，优选为1:10-1:20。
15.步骤1)中，所述复合酶为纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶构成的混合物，按重量计，复合酶为纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶＝2：1：1；所述纤维素酶的酶活力为10000-20000u/g，果胶酶的酶活力为10000-20000u/g，木瓜蛋白酶的酶活力为80000-100000u/g。
16.步骤1)中，加入复合酶的量为猴头菇子和蒸馏水总质量的1-10％，优选为4-5％。
17.步骤2)中，所述高压均质设备的均质压力为40-400mpa，优选为80-120mpa。
18.步骤2)中，高压均质提取时间为20-120min，优选为30-60min。
19.步骤2)中，高压均质提取时的提取温度为20-60℃，优选为35-40℃。
20.步骤2)中，均质1-5次，优选为2-3次。
21.步骤3)中，将均质机的压力升高到200-400mpa后终止酶解反应，优选为270-300mpa。
22.步骤3)中，所述高压灭酶活时间为5-60min，优选为10-20min。
23.步骤3)中，加入乙醇的量为上清液浓缩后体积的3倍，所述乙醇的浓度为95％；
24.步骤3)中，搅拌后低温静置24h。
25.本发明的有益效果在于：
26.(1)本发明采用高压均质技术和酶解法联用提取猴头菇多糖，工艺操作简单，溶剂用量少，效率高，提取时间短，大大提高了猴头菇多糖的提取效率；
27.(2)本发明方法提取条件温和，减少了高温灭酶活时对多糖的损失，且采用高压均质技术和酶解法使多糖的糖苷键断裂，降低多糖分子质量，提高多糖提取率和利用率。
28.(3)本发明建立了一种显著快速高效提取猴头菇多糖的工艺，是一种工艺操作简
单、快速高效、安全的提取技术，能大大节约猴头菇多糖提取时间，提高提取的效率，增加其得率，为猴头菇多糖相关制剂开发和应用奠定了基础。
附图说明
29.图1为本方法提取的猴头菇多糖的料液比单因素结果示意图；
30.图2为本方法提取的猴头菇多糖的温度单因素结果示意图；
31.图3为本方法提取的猴头菇多糖的均质压力单因素结果示意图；
32.图4为本方法提取的猴头菇多糖的料均质提取时间因素结果示意图。
具体实施方式
33.下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：
34.实施例1：一种高压均质和酶解法联用提取猴头菇多糖的方法，包括以下步骤：
35.步骤1)：取干燥的猴头菇子，粉碎，过筛(80目)，加入蒸馏水，搅拌均匀，加入复合酶，用磷酸盐缓冲液调节ph至4
±
0.5，得溶液a；本步骤中，加入复合酶的量为猴头菇子和蒸馏水总质量的1-10％，优选为4-5％。所述猴头菇子与蒸馏水的料液比为：w:v＝1:5-1:40，优选为1:10-1:20。所述复合酶为纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶构成的混合物，按重量计，复合酶为纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶＝2：1：1；所述纤维素酶的酶活力为10000-20000u/g，果胶酶的酶活力为10000-20000u/g，木瓜蛋白酶的酶活力为80000-100000u/g。
36.步骤2)：将溶液a倒入高压均质设备的容器内进行高压均质提取，均质2-3次；所述高压均质设备的均质压力为40-400mpa，优选为80-120mpa，高压均质提取时间为20-120min，优选为30-60min，高压均质提取时的提取温度为20-60℃，优选为35-40℃。
37.步骤3)：将均质机的压力升高到200-400mpa后终止酶解反应，优选为270-300mpa，之后进行高压灭酶活5-60min，优选为10-20min，之后提取液经离心机离心后取上清液，旋转浓缩，加入乙醇，低温静置24h，离心，取沉淀，真空冷冻干燥得猴头菇多糖提取物。本步骤中，加入乙醇的量为上清液浓缩后体积的3倍，所述乙醇的浓度为95％；
38.本实施方法中涉及的猴头菇多糖得率的计算方法：其中c为从葡萄糖标准曲线上计算得到的猴头菇多糖溶液的质量浓度，单位为μg/ml；v为猴头菇多糖溶液的体积，单位为ml；d为取一定滤液稀释的倍数；m为称取猴头菇的质量，单位为g。
39.实施例2，一种高压均质和酶解法联用提取猴头菇多糖的方法，包括以下步骤：
40.步骤1)：取干燥猴头菇子10g，粉碎，过筛(80目)，按1：20料液比加入蒸馏水，搅拌均匀，加入4％的复合酶，用磷酸盐缓冲液调节ph至4
±
0.5。
41.步骤2)：将溶液倒入高压均质设备的容器内，在50mpa压力下进行高压均质提取50min，均质提取2次，提取时保持在30℃。
42.步骤3)：提取结束将均质机的压力升高到200mpa终止酶解反应30min，提取液经离心机离心后取上清液，旋转浓缩，加3倍体积的95％乙醇，搅拌后，4℃冰箱静置24h，离心，取沉淀真空冷冻干燥得猴头菇多糖提取物；采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得率为11.6％。
43.实施例3，一种高压均质和酶解法联用提取猴头菇多糖的方法，包括以下步骤：
44.步骤1)：取干燥猴头菇子10g，粉碎，过筛(80目)，按1：20料液比加入蒸馏水，搅拌
均匀，加入5％的复合酶，用磷酸盐缓冲液调节ph至4
±
0.5。
45.步骤2)：将溶液倒入高压均质设备的容器内，在80mpa压力下进行高压均质提取30min，均质提取2次，提取时保持在35℃。
46.步骤3)：提取结束将均质机的压力升高到300mpa终止酶解反应10min，提取液经离心机离心后取上清液，旋转浓缩，加3倍体积的95％乙醇，搅拌后，4℃冰箱静置24h，离心，取沉淀真空冷冻干燥得猴头菇多糖提取物。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得率为19.6％。
47.实施例4，一种高压均质和酶解法联用提取猴头菇多糖的方法，包括以下步骤：
48.步骤1)：取干燥猴头菇子10g，粉碎，过筛(80目)，按1：10料液比加入蒸馏水，搅拌均匀，加入5％的复合酶，用磷酸盐缓冲液调节ph至4
±
0.5。
49.步骤2)：将溶液倒入高压均质设备的容器内，在80mpa压力下进行高压均质提取60min，均质提取3次，提取时保持在35℃。
50.步骤3)：提取结束将均质机的压力升高到200mpa终止酶解反应60min，提取液经离心机离心后取上清液，旋转浓缩，加3倍体积的95％乙醇，搅拌后，4℃冰箱静置24h，离心，取沉淀真空冷冻干燥得猴头菇多糖提取物。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得率为12.4％。
51.实施例5，一种高压均质和酶解法联用提取猴头菇多糖的方法，包括以下步骤：
52.步骤1)：取干燥猴头菇子10g，粉碎，过筛(80目)，按1：10料液比加入蒸馏水，搅拌均匀，加入5％的复合酶，用磷酸盐缓冲液调节ph至4
±
0.5。
53.步骤2)：将溶液倒入高压均质设备的容器内，在100mpa压力下进行高压均质提取60min，均质提取2次，提取时保持在40℃。
54.步骤3)：提取结束将均质机的压力升高到200mpa终止酶解反应60min，提取液经离心机离心后取上清液，旋转浓缩，加3倍体积的95％乙醇，搅拌后，4℃冰箱静置24h，离心，取沉淀真空冷冻干燥得猴头菇多糖提取物。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得率为15.6％。
55.实施例6，一种高压均质和酶解法联用提取猴头菇多糖的方法，包括以下步骤：
56.步骤1)：取干燥猴头菇子10g，粉碎，过筛(80目)，按1：20料液比加入蒸馏水，搅拌均匀，加入8％的复合酶，用磷酸盐缓冲液调节ph至4
±
0.5。
57.步骤2)：将溶液倒入高压均质设备的容器内，在80mpa压力下进行高压均质提取30min，均质提取2次，提取时保持在40℃。
58.步骤3)：提取结束将均质机的压力升高到270mpa终止酶解反应20min，提取液经离心机离心后取上清液，旋转浓缩，加3倍体积的95％乙醇，搅拌后，4℃冰箱静置24h，离心，取沉淀真空冷冻干燥得猴头菇多糖提取物。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得率为16.3％。
59.实施例7，一种高压均质和酶解法联用提取猴头菇多糖的方法，包括以下步骤：
60.步骤1)：取干燥猴头菇子10g，粉碎，过筛(80目)，按1：20料液比加入蒸馏水，搅拌均匀，加入5％的复合酶，用磷酸盐缓冲液调节ph至4
±
0.5。
61.步骤2)：将溶液倒入高压均质设备的容器内，在80mpa压力下进行高压均质提取120min，均质提取2次，提取时保持在35℃。
62.步骤3)：提取结束将均质机的压力升高到300mpa终止酶解反应10min，提取液经离心机离心后取上清液，旋转浓缩，加3倍体积的95％乙醇，搅拌后，4℃冰箱静置24h，离心，取沉淀真空冷冻干燥得猴头菇多糖提取物。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得率为17.0％。
63.实施例8，一种高压均质和酶解法联用提取猴头菇多糖的方法，包括以下步骤：
64.步骤1)：取干燥猴头菇子10g，粉碎，过筛(80目)，按1：10料液比加入蒸馏水，搅拌均匀，加入5％的复合酶，用磷酸盐缓冲液调节ph至4
±
0.5。
65.步骤2)：将溶液倒入高压均质设备的容器内，在50mpa压力下进行高压均质提取30min，均质提取5次，提取时保持在30℃。
66.步骤3)：提取结束将均质机的压力升高到200mpa终止酶解反应30min，提取液经离心机离心后取上清液，旋转浓缩，加3倍体积的95％乙醇，搅拌后，4℃冰箱静置24h，离心，取沉淀真空冷冻干燥得猴头菇多糖提取物。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得率为10.4％。
67.实施例9，一种高压均质和酶解法联用提取猴头菇多糖的方法，包括以下步骤：
68.步骤1)：取干燥猴头菇子10g，粉碎，过筛(80目)，按1：20料液比加入蒸馏水，搅拌均匀，加入8％的复合酶，用磷酸盐缓冲液调节ph至4
±
0.5。
69.步骤2)：将溶液倒入高压均质设备的容器内，在80mpa压力下进行高压均质提取30min，均质提取3次，提取时保持在40℃。
70.步骤3)：提取结束将均质机的压力升高到300mpa终止酶解反应20min，提取液经离心机离心后取上清液，旋转浓缩，加3倍体积的95％乙醇，搅拌后，4℃冰箱静置24h，离心，取沉淀真空冷冻干燥得猴头菇多糖提取物。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。得率为16.8％。
71.实施例10，本实施例为对比实施例，具体为：
72.对比例1
73.结合专利cn200810120448.1方法提取猴头菇多糖，该专利方法取干燥猴头菇子10g，粉碎，过筛(80目)，按1：20料液比加入蒸馏水，搅拌均匀，加入4％的复合酶，用磷酸盐缓冲液调节ph至4
±
0.5。将溶液在15khz超声波下提取30min，提取2次，设置温度在40℃，提取结束将温度升高到80℃，将酶灭活，反应20min。提取液经离心机离心后取上清液，旋转浓缩，加3倍体积的95％乙醇，搅拌后，4℃冰箱静置24h，离心，真空冷冻干燥得猴头菇多糖提取物。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。猴头菇多糖得率为9.6％。
74.对比例2
75.结合专利cn201911058768.3方法提取猴头菇多糖，该专利方法取燥猴头菇子10g，粉碎，过筛(80目)，将所得猴头菇粉末投入-180至-200℃液氮中，急剧降温冷冻3-5min，将已冷冻的猴头菇粉末移至高压罐，加入20ml0.8mol/l的nacl溶液溶解并35℃解冻，冷冻解冻过程重复3次，在高压罐中充入二氧化碳，使高压罐压力为4500kpa，细胞悬液内溶解大量二氧化碳，开启减压阀，使罐内压力在1-3min内降至正常大气压，取出猴头菇细胞悬液，悬液加入4％的复合酶，用磷酸盐缓冲液调节ph至4
±
0.5，在温度在40℃下提取30min，提取2次，提取结束将温度升高到80℃，将酶灭活，反应20min，提取液经离心机离心后取上清液，旋转浓缩，加3倍体积的95％乙醇，搅拌后，4℃冰箱静置24h，离心，真空冷冻干燥得猴头菇多糖提取物。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。猴头菇多糖得率为6.7％。
76.表1、不同实施例猴头菇多糖得率比较
[0077][0078]
由表1数据显示并结合图1至图4，可知，本发明方法利用高压均质和酶解法联用提取猴头菇多糖的方法，与现有专利方法的猴头菇多糖提取相比，本发明方法的猴头菇多糖得率有明显提高，本方法具有显著的技术进步。
[0079]
本发明实施例公布的是较佳的实施例，但并不局限于此，本领域的普通技术人员，极易根据上述实施例，领会本发明的精神，并做出不同的引申和变化，但只要不脱离本发明的精神，都在本发明的保护范围内。