专利名称:一种编码产碱杆菌腈水解酶的基因及其用于制备扁桃酸单一对映体的方法
技术领域：
本发明涉及一种编码腈水解酶的碱基序列，一种含有这种碱基序列的质粒，以及由这种质粒转化而得到的转化体。本发明还涉及一种可以催化扁桃腈高效且对映选择性水解为(R)-(-)-扁桃酸的基因工程重组腈水解酶，以及使用这种酶由相应的扁桃腈制备 (R)-(-)-扁桃酸及其类似物的技术方法。本发明还涉及利用这种转化体制备(R)-(-)_扁桃酸及其类似物的方法。本发明另外还涉及通过利用腈水解酶的转化体、其培养物或者其加工制品来催化扁桃腈的不对称水解制备相应的(R)-(-)_扁桃酸单一对映体及其类似物的方法。
技术背景
扁桃酸，或称α-羟基苯乙酸，是一种重要的手性合成中间体和大宗手性拆分剂， 在制药行业具有广泛的用途。相对于扁桃酸的消旋体，其单一对映体(右旋或左旋的扁桃酸)的应用价值更高。因此，简洁高效、低成本的扁桃酸单一对映体的制备方法成为研究开发的热点。
(R)-(-)-扁桃酸及其类似物是一类重要的手性合成砌块，被广泛地应用于多种药物的合成。例如，作为头孢类半合成抗生素、抗肿瘤及抗衰老药物的重要中间体；也可以作为手性拆分试剂，用于拆分其他的手性药物或医药中间体。
(R)-(-)_扁桃酸的化学结构式为
传统的化学拆分法，主要是利用手性胺类化合物，如α -甲基苄胺、㈠-麻黄碱和辛可宁等，通过与外消旋的扁桃酸形成非对映异构体盐的方法，得到扁桃酸的单一对映体。 还可利用色谱法、结晶法、膜法和超临界萃取法等物理化学方法来对扁桃酸进行对映体拆分。此外，还可利用还原剂来不对称合成(R)-(-)_扁桃酸。
最近，利用生物法合成(R)-(-)-扁桃酸正在逐渐成为研究的热点。例如，专利报道(CN 1710087,2005)以苯甲酰甲酸甲酯或苯甲酰甲酸的其它衍生物为底物，采用酵母或白地霉等微生物细胞作为催化剂，选择性地将底物中的羰基还原为羟基，从而获得以一种立体构型为主的扁桃酸单一对映体。专利(CN 1840671,2006)以筛选到的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AS 1. 818作为催化剂，不对称转化外消旋的扁桃酸得到产物(R)-扁桃酸，产物的光学纯度可达90% e.e.以上。也有文献报道利用脱氢酶选择性降解(S)_(+)_ 扁桃酸而得到(R)-(-)-扁桃酸。例如，Miyamoto 等(Biotechnol. Lett.，1992,14 :1137-1142)利用Alcaligenes bronchis印ticus拆分外消旋的扁桃酸，产率为 42%, e. e.为 97%。Jamaluddin 等(J. Bacteriol.，1970，101 :786-793)利用 Aspergillus niger脱氢酶选择性氧化外消旋的扁桃酸得到光学纯的(R)-(_)_扁桃酸。Takahashi等 (J. Ferment. Bioeng.，1995,3 :247-250)利用 Pseudomonas polycolor 转化外消旋的扁桃酸，得到(R)-(-)-扁桃酸，产率为 35%，e. e.为 99. 9%。Li GY等(Process Biochemistry, 2007,42 :1465-1469)利用壳聚糖固定化Saccharomyces cerevisiae来不对称还原苯甲酰甲酸为⑶-㈠-扁桃酸，产率为62%，e.e.为98%。
然而，上述公开报道的方法一般仅限于实验室规模，还不适用于工业化生产 (R)-(-)_扁桃酸，主要是由于还原催化剂或拆分试剂价格昂贵，物理化学方法技术要求严格，而在生物化学方法中需要先合成其转化的前体，其步骤相当繁琐且反应条件剧烈，对生态不够友好，同时还需要消耗昂贵的辅酶。
腈水解酶能够催化有机腈化合物一步水解为羧酸并产生一分子的氨，该过程反应条件温和，不需要任何辅因子的参与，反应效率极高，同时反应过程具有较好的区域和立体选择性。另一方面，反应底物扁桃腈易于大规模生产且成本低廉；更为重要的是，当 (R)-(-)_扁桃腈被对映选择性地酶促水解为(R)-(-)_扁桃酸后，剩余的(S)-(+)_扁桃腈在弱碱性条件下可以自发地消旋转化为外消旋的扁桃腈，这样理论上可以得到100%的产率。因此，如果能够获得对扁桃腈具有高水解活性和对映选择性的腈水解酶，则有望实现 (R)-(-)-扁桃酸的大规模工业化生产。
目前已有一些文献报道利用腈水解酶催化扁桃腈水解合成(R)-(-)-扁桃酸。例如，Yamamoto 等(Appl. Environ. Microbiol. ,1991,57 :3028-3032)利用 Alcaligenesfaecalis ATCC 8750转化外消旋的扁桃腈合成(R) _ (_)-扁桃酸；Kaul等 (Tetrahedron =Asymmetry, 2004,15 :207-211)利用 Pseudomonas putida 将扁桃腈水解为 (R)-(-)_扁桃酸，转化率大于40%，e.e.大于98%。但是，上述报道的方法存在的主要问题是野生菌株中酶的产量很低，催化活力不高，酶的稳定性较差，而且不能耐受高浓度的底物，因此它们的总体催化效率不高，难以应用于扁桃酸的批量生产。
发明内容
本发明提供了一种编码腈水解酶的碱基序列，同时提供了含有上述碱基序列的质粒，以及由这种质粒转化宿主而得到的转化体。本发明还提供了一种对扁桃腈显示出高活性和对映选择性的重组腈水解酶，以及利用该酶由扁桃腈制备(R)-(-)-扁桃酸的方法。
本发明所述的腈水解酶来源于产碱杆菌属菌株ECU0401 (保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No. 2009)。该菌株是发明人从土壤中分离、纯化得到的，已经申请发明专利，公开号为CN 101134943和CN101186933。
本发明所述腈水解酶的编码DNA片段可以通过如下步骤分离从产碱杆菌CGMCC No. 2009中提取基因组DNA，用限制性内切酶对基因组DNA进行消化，得到的DNA片段通过电泳分离纯化，回收DNA片段，将其插入载体质粒并转化相应的微生物宿主得到转化体库。 从库中筛选出含腈水解酶基因序列的克隆，通过对相应重组质粒测序、分析该腈水解酶基因的碱基序列，确定出编码目标腈水解酶的DNA碱基序列，并从该DNA碱基序列推断出腈水解酶的氨基酸序列。[0014]通过如上分离得到的编码本发明所述腈水解酶的DNA碱基序列包含序列表中SEQ NO. 1的碱基序列。碱基序列SEQ NO. 1编码了 SEQ NO. 2的氨基酸序列，由于密码子的简并性，编码SEQ NO. 2的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ NO. 1。另外，还可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对碱基序列SEQ NO. 1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
SEQ NO. 1的同系物也指启动子变体。在所述的碱基序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。
SEQ NO. 1或其同系物是一种具有能够在标准条件下和具有与SEQ NO. 1互补序列的多聚核苷酸进行杂交的碱基序列的多聚核苷酸。在标准条件下进行杂交可根据“分子克隆”中描述的方式进行Cold Spring Harbor Laboratory I^ress，分子生物学中的通用协议(Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行， 将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。 杂交缓冲液的组成为0. Iwt% SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2 8 X SSC0 20 X SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液。杂交温度为50 70°C。在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度为室温，更优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成为6XSSC+0. Iwt % SDS溶液，更优选为5XSSC+0. Iwt % SDS0当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或 RNA分子。
本发明所述的腈水解酶具有序列表中SEQ N0. 2的氨基酸序列，或者在保持腈水解酶的活性下，将SEQ N0. 2的氨基酸进行替换、缺失、改变或插入其中的一个或两个，优选为几个氨基酸而得到的氨基酸序列。
将所得到的编码本发明所述腈水解酶的DNA插入到一个表达质粒中，例如，当宿主是大肠杆菌时，典型的表达质粒包括PUC18、pUC19、pSClOl、pBR322、pHSl、pHS2，这样可以得到表达腈水解酶的质粒。对于宿主的选择不仅仅局限于大肠杆菌等，任何微生物只要满足重组载体可以稳定地和自动地生长，并且一些外源的DNA可以被表达即可作为转化宿主。
在本发明中，由质粒转化表达宿主得到的转化体可以基于已知信息生长并产生本发明所述的腈水解酶。任何一种人工的或天然的含有适量的碳源、氮源、无机和其他营养物质的介质，只要能够满足使宿主菌株生长并产生腈水解酶均可使用。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据培养类型和方法等因素的不同而进行适当的选择，只要使宿主菌株能够生长并产生腈水解酶即可。
用于制备本发明的(R)-(-)-扁桃酸及其衍生物的方法中的腈水解酶，可以是上述产生腈水解酶的转化体的培养物，也可以是通过将培养基离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物的腈水解酶进行分离和/或纯化得到的分离产品、或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。为了改善目标反应的反应性和选择性，可以使用有机溶剂或者在反应前和反应中处理反应体系、转化体细胞或者转化体的加工制品。有机溶剂适当的选择一种或多种醇类，如甲醇和乙醇等；可与水混合的有机溶剂，例如丙酮、二甲基亚砜、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、四氢呋喃和二甲基甲酰胺；芳香族有机溶剂如苯和甲苯；烧烃类如正己烷和辛烷。有机溶剂的用量可根据腈水解酶活性的稳定性范围而定。其他处理方法，比如利用CTAB对细胞进行通透处理，CTAB的浓度为1 10% (w/v)，处理时间为 0. 1 池。为了进一步提高反应的效率，还可以向反应体系中加入各种添加剂，例如有些金属离子会抑制腈水解酶的活性，因此，可向反应体系中加入金属离子螯合剂，例如EDTA。而有些还原试剂，如半胱氨酸和二硫苏糖醇则有利于腈水解酶的酶活。
在由腈水解酶催化相应的腈化合物水解制备本发明的(R)-(-)-扁桃酸及其衍生物时，选择对反应性如腈水解酶的活性和稳定性有利的条件有利于反应的进行。
反应中使用的介质可以是水或含有不同缓冲液的水介质。其中的缓冲液可以是向水中加入一种或多种适当选自磷酸、Tris、柠檬酸、乙酸、硼酸、氨基乙酸、HEPES、M0PS、MES、 CAPS、CHES, PIPES和其他的酸成分而得到。
本发明方法所述的pH值优选保持在腈水解酶可以表达其活性的PH范围内，优选 SpH 4.0 10.0。反应温度优选保持在腈水解酶可以表达其活性的温度范围内，优选为 20 60 。
本发明方法所述的底物浓度没有限制，通常为5 200mmol/L。考虑到反应的效率，底物浓度优选为大于等于50mmol/L，更优选为大于等于lOOmmol/L并且优选为小于等于200mmol/L。同时为了提高生产效率，可以在反应时批次添加腈。反应所生成的产物可以在反应结束后分离，也可以通过原位分离的方法不断地将产物移走。
本发明的方法中，当所使用的催化剂是静息细胞时，其用量为1 100g/L ；当使用的催化剂是固定化细胞时，其用量为5 500g/L ；当催化剂是细胞提取物时，其用量为5 100mg/L。
本发明所述的腈水解酶可以提供由扁桃腈及其衍生物得到相应的扁桃酸及其衍生物。因此，本发明中的腈水解酶可以在工业上方便地由扁桃腈及其衍生物制备光学纯的扁桃酸及其衍生物。本发明中所选的底物通式为
权利要求
1. 一种催化扁桃腈水解合成(R)-(-)_扁桃酸的腈水解酶，其特征在于，所述的腈水解酶是由产碱杆菌属Alcaligenes sp. ECU0401，保藏号为CGMCC No. 2009的菌株得到的，其由如下核苷酸序列所编码ATGCAGACAAGAAAAATCGTCCGGGCAGCCGCCGTACAGGCCGCCTCTCCCAACTACGACCTGGCAGCAGGTGTTGATAAAACCATTGAACTGGCTCGACAAGCGCGTGATGAAGGCTGCGACCTGATCGTATTTGGTGAAACCTGGTTGCCAGGCTATCCCTTCCACGTCTGGCTAGGTGCGCCGGCCTGGTCACTGAAATACAGTGCTCGTTACTATGCCAACTCACTCTCGCTGGACAGTGCAGAGTTTCAGCGCATTGCCCAGGCTGCGCGAACCTTGGGCATTTTCATCGCATTGGGCTATAGCGAACGCAGCGGTGGCAGCCTGTATCTGGGCCAATGCCTGATCGACGACAAAGGCGAGATGCTGTGGTCACGTCGCAAACTCAAACCCACGCATGTAGAGCGCACCGTATTTGGTGAGGGTTATGCCCGTGATCTGATTGTGTCCGACACAGAACTGGGACGCGTCGGCGCTCTATGCTGCTGGGAGCATTTGTCGCCCTTGAGCAAGTACGCGCTGTACTCCCAGCATGAAGCCATTCACATTGCTGCCTGGCCGTCGTTTTCGCTATACAGCGAACAGGCCCACGCCCTCAGCGCCAAGGTGAACATGGCCGCCTCGCAAATCTATTCGGTGGAAGGCCAATGCTTTACCATCGCCGCCAGCAGTGTGGTCACCCAAGAGACGCTAGACATGCTGGAAGTGGGTGAGCACAACGCCTCTTTGCTGAAAGTGGGCGGTGGCAGTTCCATGATTTTTGCACCGGACGGACGTACACTGGCTCCCTACCTGCCTCACGATGCCGAGGGCTTGATCATTGCCGATCTGGATATGGAGGAGATTGCCTTCGCCAAGGCGATCAATGACCCCGTGGGCCACTATTCCAAACCTGAAGCCACCCGTCTGGTGCTGGACTTGGGGCACCGAGAACCCATGACTCGGGTGCACTCCAAAAGCGTGACCAAGGCAGAGGCTTCCGAGCCAGGTGTGCAAAGTACGGCTACCTCAGTCGCTATCAGCCATCCACAGGACTCGGACACACTGCTCGTGCAAGAACCGTCCTGA0
2.一种含有如权利要求
1所述的核苷酸序列的重组质粒。
3.—种权利要求
2所述的重组质粒经转化宿主细胞而得到的转化体。
4.如权利要求
1所述的腈水解酶，其特征在于，它是由权利要求
1所述的核苷酸序列编码，其氨基酸序列为MQTRKIVRAAAVQAASPNYDLAAGVDKTIELARQARDEGCDLIVFGETWLPGYPFHVWLGAPAWSLKYSARYYANSLSLDSAEFQRIAQAARTLGIFIALGYSERSGGSLYLGQCLIDDKGEMLWSRRKLKPTHVERTVFGEGYARDLIVSDTELGRVGALCCWEHLSPLSKYALYSQHEAIHIAAWPSFSLYSEQAHALSAKVNMAASQIYSVEGQCFTIAASSVVTQETLDMLEVGEHNASLLKVGGGSSMIFAPDGRTLAPYLPHDAEGLIIADLDMEEIAFAKAINDPVGHYSKPEATRLVLDLGHREPMTRVHSKSVTKAEASEPGVQSTATSVAISHPQDSDTLLVQEPS。
5.一种如权利要求
1所述的腈水解酶用于催化合成(R)-(-)_扁桃酸及(R)-(-)_邻氯扁桃酸的用途。
6.如权利要求
5所述的用途，其特征在于所述的腈水解酶采用如下步骤催化合成(R)-(-)-扁桃酸及(R)-(-)-邻氯扁桃酸(1)对权利要求
3所述的转化体进行增殖培养，表达目标蛋白，收集重组微生物细胞；(2)将收获的重组微生物静息细胞或对重组微生物细胞进行海藻酸钙包埋固定化处理后得到的固定化重组细胞悬浮于pH为4. 0 10. 0的Tris-HCl或柠檬酸盐缓冲液中，加入扁桃腈或邻氯扁桃腈作为底物，在20 60°C反应1 10小时，然后从反应液中分离提取目标产物。
7.根据权利要求
6所述的用途，其特征在于所述的步骤( 中，所述的底物浓度为5 200 mmol/L ；所述的静息细胞在缓冲液中的含量为1 100 g/L。
8.根据权利要求
6所述的用途，其特征在于，使用固定化重组细胞转化时，固定化重组细胞在缓冲液中的含量为5 500 g/L。
专利摘要
本发明涉及编码具有腈水解酶活性的多肽的碱基序列，涉及包含该碱基序列的载体，并涉及含有该碱基序列或载体的转化体，其中所述的载体包含该碱基序列或碱基序列与相应的信号序列相连接的组合体。本发明还涉及由该碱基序列编码的氨基酸序列。本发明另外还涉及利用该重组表达的腈水解酶作为催化剂，由相应的扁桃腈制备扁桃酸单一对映体及其类似物的技术方法。
文档编号C12N15/63GKCN101701222 B发布类型授权 专利申请号CN 200910049506
公开日2011年11月16日 申请日期2009年4月17日
发明者刘俊峰, 张志钧, 潘江, 许建和 申请人:华东理工大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),