。在该实验中标准品的 稀释倍数为5倍，10倍，20倍，50倍，100倍以及溶解于400y1的岩藻黄素标准品。
[0033]本次实验所用的柱子型号为 250X4. 6mml.D.S-5y m，12nmAA12S05-2546WT No. 0425057734。所用的HPLC机型为Waters2695SeparationsModule。
[0034] 本次实验条件为：90 %甲醇30min，100 %甲醇10min，90 %甲醇持续15min。 200-700nm的波长。在445nm处进行监测。
[0035] 二、应用实施例
[0036] 实施例1硫酸铈铵对三角褐指藻中岩藻黄素的影响
[0037] 分别取300ml的灭菌MAD培养液18组，接入1 : 10的比例接入三角褐指藻藻体。 使用浓度分别为〇. 2mg/L，0. 4mg/L，0. 8mg/L，1. 6mg/L，2mg/L的硫酸铺按处理三角褐指藻 和不做任何处理的平行3组。从三角褐指藻接入培养基的那天开始，每天需要利用分光光 度计来测定每组藻液的浓度，再测定6天。
[0038] 结果如图1所示，当加入不同浓度的硫酸铈铵（CAS)后各组的吸光值变化不是很 明显，对照组对数期末的吸光值相对来讲比其他几组的吸光值都要大，0. 4mg/L的硫酸铈铵 处理藻体后，0D值最小。其中对照组的0D值为0. 4322,0. 4mg/L的实验组的0D值为0. 3371， 对照组是其1.3倍。说明通过硫酸铈铵处理后，三角褐指藻的生物量下降。从图中还可以 看出，利用硫酸铈铵处理三角褐指藻后，从第5天开始都处于衰亡期，其吸光值都呈下降的 趋势。
[0039] 实施例2
[0040] 取400ml的灭菌海水7组，分别加入400y1的MAD母液。加入40ml的三角褐指 藻母液于培养液中于光照培养箱中培养。培养2天后，在其中的6组藻培养液中加入不同 浓度的硫酸铺按，其浓度分别为 〇mg/L，0? 2mg/L，0? 4mg/L，0? 8mg/L，1. 6mg/L，2.Omg/L。
[0041] 如图2所示，由三角褐指藻的生长曲线的测定可知，培养至第6天后可知三角褐指 藻已经达到了对数期末，可以得到最大的生物量。因此到了培养到第6天的时候就需要收 集藻液。
[0042] 将每组三角褐指藻分别取80ml于离心管中，4°C，5000rpm，离心10min，弃上清，取 lml的MAD海水培养基，重悬离心藻体，并且将藻液移入1. 5mlEP管中，4°C，5000rpm，离心 10min，弃上清并且称量其鲜重。用封口膜将EP管的管口封好，用接种针将封口膜扎几个小 洞，放于冷冻干燥机中干燥2天，取出EP管，将封口膜撕去，由于三角褐指藻属于硅藻类，因 此其细胞壁很厚，不能将其内容物取出。采用研磨棒研磨干燥的三角褐指藻藻体，使其细胞 壁充分破裂，取lml的无水乙醇于EP管中，并且用移液枪上下重悬，使得岩藻黄素充分溶解 于无水乙醇中。4°C环境中静置lh，4°C，13000rpm，离心10min。吸取上清液于新的1.5ml 的EP管中。
[0043] 利用HPLC(高效液相色谱）在445nm的吸收波长下监测岩藻黄素。不同浓度的 硫酸铺按处理三角褐指藻后，通过计算，结果如图3和表1所示，在浓度范围为0mg/L? 0. 2mg/L时，每克三角褐指藻鲜重所得的岩藻黄素含量呈现递增的趋势，从0. 2mg/L-2mg/ L过程中岩藻黄素含量呈现递减的趋势。从图中可以看出在0.2mg/L的硫酸铈铵处理三 角褐指藻后所得的岩藻黄素含量最多，为〇. 398mg/g鲜重，硫酸铈铵浓度为2mg/L，所得的 岩藻黄素含量最低，为0. 158mg/g鲜重。未经过处理的三角褐指藻其岩藻黄素的含量为 0? 249mg/g鲜重。
[0044]表1不同浓度硫酸铈铵处理对三角褐指藻岩藻黄素含量的影响
【主权项】
1. 一种用硫酸铈铵提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 取灭菌海水与MAD母液混合获得营养液； 2) 在营养液中加入三角褐指藻母液培养； 3) 培养2天后，加入硫酸铈铵； 4) 继续培养6天后手机藻液，离心分离，弃上清，收集藻体； 5) 将藻体冷冻干燥处理2天，研磨备用。
2. 根据权利要求1所述的一种用硫酸铈铵提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其 特征在于：所述的 MAD 母液的配方每 100ml 为：KN03:10g，KH2P0 4:lg，FeSO 4 ? 7H20 :0. 25g， MnS04:0 . 0 2 5g，EDTANa 2:lg，V B1:0. 0006g，去离子水：100ml。
3. 根据权利要求1所述的一种用硫酸铈铵提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其特 征在于：所述的培养条件为：5000千勒克斯，25°C。
4. 根据权利要求1所述的一种用硫酸铈铵提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其特 征在于： 所述的灭菌海水与MAD母液的体积比为1 : 1000; 所述的营养液与三角褐指藻母液的体积比为1 : 10。
5. 根据权利要求1所述的一种用硫酸铈铵提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其特 征在于：步骤（3)中培养液加入硫酸铈铵后硫酸铈铵的浓度为Omg/L?0. 2mg/L。
6. 根据权利要求1所述的一种用硫酸铈铵提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其特 征在于：步骤（5)所述的干燥处理条件为：温度-70°C，压强999Pa。
【专利摘要】本发明公开了一种用硫酸铈铵提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，取灭菌海水与MAD母液混合获得营养液，在营养液中加入三角褐指藻母液培养，培养2天后，加入硫酸铈铵，继续培养6天后收集藻液，离心分离，弃上清，收集藻体，将藻体冷冻干燥处理2天，研磨备用，用无水乙醇溶解研磨所得藻体，4℃环境中静置1h，4℃，13000rpm，离心10min，得上清液。该发明操作简单方便，费用低，生产周期短，适于批量处理和工厂化生产。
【IPC分类】C12N1-38, C12N1-12, C12R1-89
【公开号】CN104531602
【申请号】CN201410743644
【发明人】朱帅旗, 龚一富, 刘浩, 刘诗洁, 魏朝广, 刘钊, 王何瑜
【申请人】龚一富
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月10日