磁性纳米 颗粒加入到45mL富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶型化合物溶液中，80°C220w超声分散 30min，得到磁性Fe304、碳纳米管和琼脂糖的悬浊液。将悬浊液加入由216mL甲苯、84mL三 氯甲烷和4. 5mL司班80组成的有机溶剂和表面活性剂的混合溶液中，65°C，1000r/min，强 力搅拌20min，得到均匀体系。对均匀体系持续搅拌，自然冷却后，用大量乙醚和双蒸水清 洗。磁性分离得到枝接有碳纳米管的磁性纳米颗粒。将碳纳米管枝接磁性纳米颗粒低温旋 转蒸干，研磨后筛选粒径200目以下颗粒，即制得固定化酶载体。高胶熔点琼脂糖包裹在磁 性纳米颗粒表面形成富羟基壳，其平均厚度为20nm。
[0036] 将所获得的固定化酶载体应用于碳酸酐酶的固定化中，制备固定化的碳酸酐酶， 并测定其固定化效率及催化活力。
[0037] 取碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒250mg，分散于10mL5mg/mL的碳酸酐酶弱碱性 磷酸钾盐缓冲溶液（50mmol/LpH7. 0?8. 5)中，pH为8. 0, 28°C，摇床混合5h，摇床转速 为200r/min。使碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒与待固定化的碳酸酐酶通过非特异性吸附结 合，即形成碳纳米管枝接的磁性纳米固定化碳酸酐酶。磁性分离并清洗颗粒，获得纯净的碳 纳米管枝接的磁性纳米固定化碳酸酐酶。
[0038] 作为对照，取碳纳米管250mg，按照上述同样的固定化方法，获得碳纳米管固定化 碳酸酐酶。
[0039] 将制备的固定化碳酸酐酶通过pH电极法测定催化活力，固定化酶每克蛋白的单 位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力定义为单位酶活回收率，结果见表1。结果 显示：本发明中的固定化载体制得的固定化碳酸酐酶与碳纳米管固定化的碳酸酐酶，催化 效率相差无几，在酶催化完成后，采用外加磁场方式实现固定化酶的快速分离，操作简便， 分离彻底。而碳纳米管固定化酶由于颗粒尺寸较小，分离则需要抽滤、离心等能耗较高的方 式，增加了固定化酶批次使用的成本。
[0040] 将所获得的固定化酶载体应用于木聚糖酶的固定化中，制备固定化的木聚糖酶， 并测定其固定化效率及催化活力。
[0041] 取碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒250mg，分散于10mL5mg/mL的木聚糖酶梓檬酸 钠盐缓冲溶液（50mmol/LpH4. 8?5. 0)中，pH为4. 8,28°C，摇床混合5h，摇床转速为200r/ min。使碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒与待固定化的木聚糖酶通过非特异性吸附结合，即形 成碳纳米管枝接的磁性纳米固定化木聚糖酶。磁性分离并清洗颗粒，获得纯净的碳纳米管 枝接的磁性纳米固定化木聚糖酶。作为对照，取碳纳米管250mg，按照上述同样的固定化方 法，获得碳纳米管固定化木聚糖酶。
[0042] 将制备的固定化木聚糖酶通过DNS显色法测定催化活力，结果见表1。结果显示： 固定化酶每克蛋白的单位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力为29%，本发明中的 固定化载体制得的固定化木聚糖酶与碳纳米管固定化的木聚糖酶，催化效率相差无几，同 时在酶催化完成后，采用外加磁场方式实现固定化酶的快速分离，操作简便，分离彻底。而 碳纳米管固定化酶由于颗粒尺寸较小，分离则需要抽滤、离心等能耗较高的方式，增加了固 定化酶批次使用的成本。
[0043] 将所获得的固定化酶载体应用于葡萄糖苷酶的固定化中，制备固定化的 0 _葡萄糖苷酶，并测定其固定化效率及催化活力。
[0044] 取碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒250mg，分散于10mL5mg/mL的0-葡萄糖苷酶梓 檬酸钠盐缓冲溶液（50mmol/LpH4. 8?5. 0)中，pH为5. 0, 5°C，摇床混合4h，摇床转速为 200r/min。使碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒与待固定化的0-葡萄糖苷酶通过非特异性吸 附结合，即形成碳纳米管枝接的磁性纳米固定化葡萄糖苷酶。磁性分离并清洗颗粒，获 得纯净的碳纳米管枝接的磁性纳米固定化葡萄糖苷酶。作为对照，取碳纳米管250mg， 按照上述同样的固定化方法，获得碳纳米管固定化0 _葡萄糖苷酶。
[0045] 将制备的固定化葡萄糖苷酶通过pNPG显色法测定催化活力，结果见表1。结 果显示：固定化酶每克蛋白的单位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力为76%，本 发明中的固定化载体制得的固定化葡萄糖苷酶与碳纳米管固定化的葡萄糖苷酶， 催化效率相差无几，同时在酶催化完成后，采用外加磁场方式实现固定化酶的快速分离，操 作简便，分离彻底。而碳纳米管固定化酶由于颗粒尺寸较小，分离则需要抽滤、离心等能耗 较高的方式，增加了固定化酶批次使用的成本。
[0046] 表1实验结果比较
[0047]
【主权项】
1. 一种固定化酶载体，其特征在于，包括磁性纳米颗粒、亲水性溶胶-凝胶型化合物以 及碳纳米管，亲水性溶胶-凝胶型化合物包裹在磁性纳米颗粒表面形成富羟基壳，富羟基 壳包裹碳纳米管的一端，将碳纳米管枝接在磁性纳米颗粒表面。
2. 根据权利要求1所述的固定化酶载体，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为纳米铁氧 化物、纳米钛氧化物或纳米娃氧化物；磁性纳米颗粒粒径为50~200 nm。
3. 根据权利要求1所述的固定化酶载体，其特征在于，所述亲水性溶胶-凝胶型化合物 为高熔点琼脂糖或壳聚糖，其溶胶温度为40~80°C。
4. 根据权利要求1所述的固定化酶载体，其特征在于，所述碳纳米管为多壁碳纳米管 或单壁碳纳米管，其长度为50~500nm，每克固定化酶载体枝接有50~500mg碳纳米管。
5. 根据权利要求1所述的固定化酶载体，其特征在于，所述富羟基壳的平均厚度为 20~100nm〇
6. -种制备权利要求1~5任意一项所述固定化酶载体的方法，其特征在于，包括以下 步骤： 1) 制备磁性纳米颗粒； 2) 将亲水性溶胶-凝胶型化合物溶于水中，加热至沸腾形成浓度为10~50g/L溶胶；将 碳纳米管加入至沸腾的溶胶中，70~100°C 220w超声分散30min，获得富含碳纳米管的亲水 性溶胶_凝胶型化合物溶液； 3) 将磁性纳米颗粒加入到富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶型化合物溶液中， 70~100°C 220w超声分散30min，得到磁性Fe304、碳纳米管和琼脂糖的悬浊液；将悬浊液加 入积比为50~100:1的甲苯-三氯甲烷溶液、司班80组成的混合溶液中，65°C，1000r/min， 强力搅拌20~30min，得到均匀体系； 4) 对均匀体系持续搅拌，自然冷却后，用乙醚和双蒸水清洗；磁性分离得到枝接有碳纳 米管的磁性纳米颗粒；将碳纳米管枝接磁性纳米颗粒低温旋转蒸干，研磨后筛选粒径200 目以下颗粒，即制得固定化酶载体。
7. 根据权利要求6所述的固定化酶载体制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的碳纳 米管在溶胶凝胶型化合物溶液中的质量浓度为l〇~l〇〇g/L。
8. 根据权利要求6所述的固定化酶载体制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的磁性 纳米颗粒在富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶化合物溶液中的质量浓度为5~50g/L。
9. 权利要求]-5任意一项所述固定化酶载体在制备固定化酶中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，所述的酶包括碳酸酐酶、木聚糖酶和0 -葡萄糖苷酶。
【专利摘要】本发明公开了一种固定化酶载体及其制备方法和应用。所述固定化酶载体，包括磁性纳米颗粒、亲水性溶胶-凝胶型化合物以及碳纳米管，亲水性溶胶-凝胶型化合物包裹在磁性纳米颗粒表面形成富羟基壳，富羟基壳包裹碳纳米管的一端，将碳纳米管枝接在磁性纳米颗粒表面。本发明固定化酶载体与生物酶结合催化效率高，便于酶的回收再利用，能有效降低工业生产的成本。
【IPC分类】C12N11-14
【公开号】CN104531668
【申请号】CN201410831584
【发明人】祝俊, 余允东, 陈亭亭, 张敏, 汪浩, 张燕, 周晓青, 龙辉, 陈风义
【申请人】上海立足生物科技有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月23日