量为 27. 8mg/L，亚硝酸盐氮含量为0. 003mg/L，硝酸盐氮含量为116. 2mg/L，固体悬浮物含量为 49.lmg/L，pH为8. 6)，实验证明，本发明提供的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4能在未经稀 释以及1倍、2倍、3倍和4倍稀释的该废水中生长，并显著降低该废水的0? &和A0X，由此 证明该菌株可以耐受pH为7. 0?8. 6的碱度变化，并能表现出优良的0?&和A0X降解活 性和生长活性。并且对于该污灌苇田造纸废水的2倍稀释水，其中，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌 訂父11-4在好氧条件下的0? &和4(?降解率均为最高，分别为71.8%和62.8%;在厌氧条 件下，0?&和A0X降解率分别为67. 4 %和55 %。这说明，在高碱度条件以及厌氧或好氧条 件下，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4均表现出了优良的0?&和AOX降解活性。因此，作 为优势降解污灌苇田造纸废水的兼性好氧耐碱细菌，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在污 灌苇田造纸废水的生物净化中具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0027] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0028] 图1为TEM电镜下纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的鞭毛（X23000)。
[0029] 图2为TEM电镜下纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的芽孢（X18500)。
[0030] 图3为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的系统发育树。
【具体实施方式】
[0031] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0032] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的 药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中，污灌苇田造纸废水和土 (泥）样均采自胜达集团江苏双灯纸业有限公司。
[0033]实施例1纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的分离、纯化及鉴定
[0034] 1.分离及纯化
[0035] 试验土样采样：用专门的植物根系采样器（购自荷兰Eijkelkamp公司）采集_田 土壤。随机选取芦苇若干株，连根带土缓缓提出，剪切除去茎部，称重，在一个大的塑料袋中 缓缓抖落根围土壤，至土壤重量剩下1/5,即为根际土壤，而其余的4/5即为本体土壤，用植 物根系采样器采集本体土壤作为试验土样。土样封装于45ml无菌取样管中，置于4°C冰箱 保存。
[0036] 土样菌悬液制备：称取土样l〇g，放入装有玻璃珠的500mL锥形瓶中，向其中加入 150ml双蒸水，振摇约2h，使土样与水充分混合，形成土样菌悬液。
[0037] 典型微生物的分离纯化：采用涂布分离法进行计数和初步分离，适当稀释土样菌 悬液，分别接种在牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基和马丁氏培养基上进行好氧和厌 氧培养。细菌于37°C培养24h，放线菌于28°C培养5?7d，真菌于28°C培养3?4d。挑选 菌落数在50-250个的平板进行计数，选取数量多且在6个苇田F1?F6中分布广的菌落作 为造纸废水污灌苇田中的典型微生物。采用划线分离法对初步分离的典型微生物单菌落逐 个反复划线或涂布，最终获得菌落纯的好氧和厌氧的细菌、放线菌和真菌的典型菌株共157 株。其中，命名为"WTXJ1-4"的一株细菌数量最多，在F1中达最大，为1. 1X107个菌株/g 土样；分布也较广，在造纸废水污灌年份较长的F1?F4中均有分布。因此，WTXJ1-4菌株 为造纸废水污灌苇田中的一株能够适应该污灌造纸废水的典型细菌。
[0038] 2?鉴定
[0039] 对筛选出的WTXJ1-4菌株进行形态学观察（菌落形态和细胞形态、特殊构造），同 时委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行16S rDNA序列分析，测序结果见序列表中 的SEQ ID N0:1。
[0040] 形态学观察发现，菌株WTXJ1-4的菌落较小，圆形，光滑，隆起，边缘整齐，在培 养基正、反面颜色均为乳白色。该菌细胞呈直杆状，直杆两端圆头，细胞大小约为1.4? 2. 8X0. 5?0. 8ym，长有数根鞭毛，端生①0. 3?0. 4ym短圆形芽孢，进一步的生理生化 鉴定试验和结果包括，菌株的革兰氏阳性，V.P试验阳性，甲基红试验阳性，吲哚试验阳性， 能水解明胶，不能水解淀粉。委托南京农业大学生命科学实验中心通过Tecnai-12透射电 子显微镜（TransmissionElectronMicroscope，TEM)观察WTXJ1-4的细胞形态、鞭毛和芽 孢，见图1和图2。
[0041] 获得WTXJ1-4的16SrDNA序列，将其与Genbank中的基因序列进行同源性比 较，发现其属于赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus)属，然后通过建立系统发育树（图3)， 发现WTXJ1-4可能为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillusfusiformis)。结合形态 学观察（图1和图2)和生理生化试验结果，最终确定WTXJ1-4为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌 (Lysinibacillusfusiformis)〇
[0042] 3.兼氧性
[0043] 将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4涂布于牛肉膏蛋白胨或LB营养琼脂培养基上， 分别于28?30°C的生化好氧培养箱中和厌氧培养箱中培养1?2天，每天观察菌落和菌苔 的生长情况。结果表明，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在好氧和厌氧条件下均能正常生 长，因此，确定纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4为兼氧菌。
[0044] 实施例2纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在有氧和无氧条件下的耐碱性和污灌 苇田造纸废水降解作用
[0045] 取污灌苇田造纸废水，该废水的(1)0&为3.OX103mg/L，A0X为11. 7mg/L，氨氮含量 为27. 8mg/L，亚硝酸盐氮含量为0. 003mg/L，硝酸盐氮含量为116. 2mg/L，固体悬浮物含量 S49.1mg/L，pHS8.6。
[0046] 将该废水稀释1倍、2倍、3倍和4倍，得到1/2倍原水、1/3倍原水、1/4倍原水和 1/5倍原水，与未经稀释的废水（1倍原水）作为培养液。将实施例1获得的纺锤形赖氨酸 芽孢杆菌WTXJ1-4用无菌水稀释成适当浓度的菌悬液，分别接种于100mL得到的不同稀释 液以及未经稀释的废水中，使WTXJ1-4的接种量为3. 25X107个菌株/ml培养液，然后分别 于35°C水浴恒温振荡器培养4天，测定培养液中？11、0)0&、4(?、0)0 &降解率（％)和40父降 解率（％ )。所做培养分成有氧组和无氧组，其中有氧组为150r/min振荡培养，培养液的瓶 装量为35% (V/V)，无氧组为在培养液表面加约lcm的液体石蜡，其它条件与有氧组相同。
[0047] 上述实验平行进行2组，分别为试1和试2,同时将不接种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌 WTXJ1-4的培养液作为空白，结果如表1所示。
[0048]表ILysinibacillus fusiformisWTXJ1-4 培养 4 天的试验结果
[0049]
【主权项】
1. 一株能够降解污灌苇田造纸废水的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis)WTXJl-4,其保藏编号为 CGMCC No. 10053。
2. 根据权利要求1所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在降解污灌苇田造纸废水中 的用途。
3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述降解污灌苇田造纸废水包括，将所述 纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4直接接种于污灌苇田造纸废水中进行培养。
4. 根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述污灌苇田造纸废水的COD & 为 5. 0 X 102?3. 0 X 10 3mg/L，优选为 5. 0 X 102?2. 0 X 10 3mg/L，更优选为 8. 0 X 102? 1. 5 X 103mg/L，进一步优选 1. 0 X 103?1. 2 X 10 3mg/L ; 优选地，所述污灌苇田造纸废水的7. 0?8. 6,优选为7. 5?8. 6,进一步优选8. 0。
5. 根据权利要求2至4中任一项所述的用途，其特征在于，所述纺锤形赖氨酸芽孢杆 菌WTXJ1-4的接种量为1. 0 X 107?8. 0 X 10 7个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水，优选为 2. 0 X 107?5. 0 X 10 7个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水，更优选为3. 0 X 10 7?4. 0 X 10 7个 菌株/ml所述污灌苇田造纸废水； 优选地，培养条件为30?37°C，120?160r/min ;培养液的瓶装量为30?40% (V/V)。
6. -种降解污灌苇田造纸废水的方法，其特征在于，所述方法包括，将权利要求1所述 的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4接种于污灌苇田造纸废水中进行培养。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述污灌苇田造纸废水的COD &为 5. 0 X 102?3. 0 X 10 3mg/L，优选为 5. 0 X 102?2. 0 X 10 3mg/L，更优选为 8. 0 X 102? 1. 5 X 103mg/L，进一步优选 1. 0 X 103?1. 2 X 10 3mg/L ; 优选地，所述污灌苇田造纸废水的pH为7. 0?8. 6,优选为7. 5?8. 6,进一步优选8. 0。
8. 根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4 的接种量为1. 〇 X 107?8. 0 X 10 7个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水，优选为2. 0 X 10 7? 5. 0 X 107个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水，更优选为3. 0 X 10 7?4. 0 X 10 7个菌株/ml所 述污灌苇田造纸废水； 优选地，培养条件为30?37°C，120?160r/min ;培养液的瓶装量为30?40% (V/V)。
9. 权利要求1所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在制备用于治理污灌苇田造纸废 水的生物降解剂中的用途。
10. 权利要求1所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在构建用于降解污灌苇田造纸 废水的工程菌中的用途。
【专利摘要】本发明提供了一株造纸废水污灌苇田中的兼性好氧典型耐碱细菌——纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的筛选及其应用。所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)WTXJ1-4，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期2014年11月25日，保藏编号为CGMCC No.10053。本发明提供的菌株能耐受pH为7.0～8.6的碱度变化，并能表现出优良的CODCr和AOX降解活性和生长活性，在污灌苇田造纸废水的生物净化中具有良好的应用前景。CGMCC No. 1005320141125
【IPC分类】C02F103-28, C12R1-01, C02F3-34, C12N1-20
【公开号】CN104593296
【申请号】CN201410853541
【发明人】丁成, 李朝霞, 陈天明, 杨文骏, 韩香云, 肖波, 王兰华
【申请人】盐城工学院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月31日