醇溶剂，并浓缩 提取液体。
[0041] 4?微波辅助提取原花青素
[0042] 1)在550W微波条件下进行微波处理，时间为lOmin，微波设置短时间多次破碎 方式，每次微波时间为〇. 5s，间隔时间为0. 5s。期间如反应液温度超过设定的报警温度 (45°C)则微波停止。
[0043] 2)离心处理：将经过微波处理过的提取液在3000r/min下离心lOmin。
[0044] 5?真空浓缩
[0045] 1)取离心后的上清液，在35°C下真空浓缩。
[0046] 2)将得到的浓缩上清用0. 45yM的滤膜进行过滤、浓缩。
[0047] 6.制备葡萄原花青素冻干粉
[0048] 1)将得到的浓缩上清用0? 22yM过滤除菌。
[0049]2)除菌后进行冻干处理，冻干温度为_25°C，真空度为lOOPa，冻干时间为28小时， 即得到葡萄果原花青素成分冻干粉。将冻干粉分装成lml/支。
[0050] 7.原花青素含量的测定
[0051] 1)测定原理：原花青素和儿茶素类单体的A环化学活性较高，在酸性条件下，其上 的间苯二酚或间苯三酚与香草醛发生缩合反应，产物在浓酸作用下形成有色的正碳离子， 样品的浓度与产生的颜色呈正相关，在500nm波长下测定其吸收光度。
[0052] 2)测定方法：香草醛-硫酸法测定
[0053]A?标准曲线的建立：配制0? 025~0? 25ii mol/ml儿茶素标准品甲醇溶液，依次加 入0. 5ml不同浓度标准品溶液、2. 5ml的1%香草醛-甲醇溶液及2. 5ml的30%H2S04-甲 醇溶液，混匀后于30°C水浴避光反应15min后于500nm处测定吸光值。以吸光值A为横坐 标，原花青素浓度为纵坐标绘制标准曲线。
[0054] B.样液含量测定：将实施例1制得的原花青素浓缩液稀释到0. 05~0. 25ii mol/ ml，精密移取0. 5ml待测液，加入2. 5ml香草醛-甲醇溶液和及2. 5ml的30%H2S04-甲醇 溶液，混匀后于30°C水浴避光反应15min。空白对照为无水甲醇。
[0055] C?原花青素含量的计算方式：
[0056]原花青素（％ ) = (CXNXV+M)X100%
[0057] C一稀释后提取液中原花青素浓度（mg/ml);
[0058]N-提取液稀释倍数；
[0059] V-提取液体积，ml;
[0060]M-葡萄质量，mg。
[0061] 结果表明：按照本发明的提取方法，并根据上述原花青素含量的计算公式可以得 到葡萄果和葡萄皮中的原花青素提取率，其含量为42. 67%，相对现有的技术方法，其提取 率相对大大地提高。
[0062] 8?原花青素的鉴定
[0063] 1)鉴定原理：原花青素本身属于多酚类物质的一种，因而可以用鉴定多酚的方 式，即使用薄层层析来鉴定原花青素。薄层层析法（吸附色谱），吸附性薄层色谱法是将吸 附剂在光洁的表面上均匀地铺成薄层，而后在在上面点上样品，以流动相开展，这样样品组 分不断地被吸附剂吸附，而被流动相溶解，解吸而向前移动。由于吸附剂对不同组分有不同 的吸附能力，流动相也有不同的解吸能力，因而流动相在向前移动的过程中，不同组分的物 质将被分开。如果各组分本身有颜色则薄层板干燥后会出现一些列高低不同的斑点，如果 本身没有颜色，则可用各种显色方法使之显色。
[0064] 2)测定方法：制备所需的层析板，将实施例1制备的原花青素浓缩液在薄层上展 开。
[0065] 3)测定结果：在薄层层板上会出现一个淡黄色色斑，向其喷显色剂，出现蓝色，证 明所分离得到的提取产物为多酚类原花青素。
[0066] 实施例2
[0067]具体的制备方法与实施例1基本相同，不同的是：
[0068] 步骤2中甲醇、乙醇和水溶液按体积比为0.5:1:2配制成混合溶液，步骤3中 在-0. 30mPa的条件下进行负压冻溶。步骤4中微波辅助提取原花青素时，首先，在550W 微波条件下进行微波处理，时间为15min，微波设置短时间多次破碎方式，每次微波时间为 〇.8s，间隔时间为0.5s。期间如反应液温度超过设定的报警温度（45°C)则微波停止。最 后,离心处理时将经过微波处理过的提取液在2000r/min下离心20min。
[0069] 将实施例2制得的原花青素用于以下动物实验
[0070] 取昆明种小鼠50只（每只体重在15g~20g)，随机分成5组：空白对照组、模型 对照组、原花青素高、中、低三个剂量组，分别记为A、B、C、D、E组。对C、D、E组分别灌服用 150、100、50mg/kg体重的原花青素，A组给予同体积蒸馏水。4周后处死动物，用生化的方 法测定局部的S0D和HYP含量，其具体结果如下：
[0071]
【主权项】
1. 一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 准备葡萄皮和葡萄果肉：将葡萄果剔除葡萄籽得到葡萄皮和葡萄果肉； (2) 萃取原花青素：按体积比为（0. 5-2) : (0. 5-2) : (0. 5-2)配置甲醇、乙醇和水溶液成 混合溶液，将混合溶液与步骤（1)准备的葡萄皮和葡萄果肉混合，反应12-36小时； (3) 步骤（2)反应后，将反应物进行固液分离得到提取液，在（-0. 30MPa)-(-0.05MPa) 的条件下，对提取液用水冻溶，并浓缩； (4) 微波提取原花青素：在400-650W微波条件下对提取液处理6-15min，离心； (5) 浓缩：将步骤（4)离心后的上清液进行浓缩，得到浓缩的原花青素提取液。
2. 根据权利要求1所述的一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法，其特征在于，将 步骤（1)中所述葡萄皮和葡萄果肉捣碎。
3. 根据权利要求1所述的一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法，其特征在于，步 骤（2)中所述甲醇、乙醇和水的体积比为1:1:1，所述混合溶液与步骤（1)准备的葡萄皮和 葡萄果肉混合后反应24小时。
4. 根据权利要求1所述的一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法，其特征在于，步 骤（3)中将所述固液分离得到提取液在-0. lOMPa下用0°C以下的水冻溶；步骤（4)中在 550W微波条件下对所述提取液处理。
5. 根据权利要求1所述的一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法，其特征在于，步 骤（4)中所述对提取液处理采用短时间多次微波处理的方式，每次微波时间为0.3-0. 8S， 时间间隔为〇. 3-0. 8S。
6. 根据权利要求5所述的一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法，其特征在于，步 骤（4)中每次微波时间为0. 5S，时间间隔为0. 5S，提取液温度超过40-50°C则反应停止；所 述微波处理过的提取液在2000-4000r/min下离心5_20min。
7. -种将权利要求1所述的方法制得的葡萄果中原花青素提取物制成原花青素冻干 粉的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 过滤：收集浓缩的原花青素提取液，用孔径小于0. 45 y M的滤膜过滤； (2) 浓缩：浓缩上清液； (3) 过滤：将浓缩的上清液采用孔径小于0. 22 y M的滤膜过滤； (4) 冻干处理：冻干温度为（_20°C )-(_35°C )，真空度为50-200Pa，冻干时间为24-36 小时，即得到原花青素冻干粉。
8. 权利要求7所述的方法制得的原花青素冻干粉在抗衰老护肤品中应用。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗衰老护肤品为面膜、爽肤水、面霜、乳 液、眼霜、洗面乳。
10. 如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述原花青素冻干粉在抗衰老护肤品中的 添加量为1-1000 y g/ml。
【专利摘要】本发明公开了一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法，包括以下步骤：(1)准备葡萄皮和葡萄果肉：将葡萄果剔除葡萄籽得到葡萄皮和葡萄果肉；(2)萃取原花青素：配置甲醇、乙醇和水溶液成混合溶液，将混合溶液与步骤(1)准备的葡萄皮和葡萄果肉混合，反应；(3)将反应物进行固液分离得到提取液，在负压的条件下，对提取液用水冻溶，并浓缩；(4)微波提取原花青素：在550W微波条件下对提取液处理，离心；(5)浓缩：将离心后的上清液进行浓缩，得到浓缩的原花青素提取液。本发明提取效率更高，提取的原花青素化合物具有抗衰老等功效，应用于抗衰老美容行业中。
【IPC分类】C07D311-62, A61K8-49, A61Q19-08
【公开号】CN104628698
【申请号】CN201510074121
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 池诗源, 王小燕
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月11日