95°C，10min;95°C，15Sec; 60。 Imin ；95°C, 15 Sec ；60°C, 15 Sec ； 四、验证目的基因表达 分析统计CEACAM5 mRNA的相对表达量，采用SDS 2. 3软件分析结果，Ct为每个反应 管内的英光信号到达设定的阔值时所经历的循环数，采用比较Ct值法计算样本中CEACAM5 mRNA相对表达量；计算2'（- A Ct)值表示样品中目的基因初始mRNA相对表达量，A Ct是 同一个样本中目的基因Ct值减去内参Ct值；按2' (- A Ct)换算成基因表达量；W样本2 的2'（- A Ct)值校正为1作为参照，计算出目的基因的相对表达量；使用SPSS19. 0统计软 件，计数数据W均数+标准差0表示；W户< 0. 05为差异有统计学意义，W户< 0. 01为 差异有显著统计学意义。
[0017] 本发明上述方法不属于专利法25条第3款规定的疾病的诊断与治疗方法。原因 如下；其一，该方法在体外实施；其二，根据该方法得出的结果，无论好坏都不能直接作为 判断疾病与否的指标，该结果只能用于评估特定人群(糖尿病患者，尤其是2型糖尿病患者） 将来患结直肠癌的可能性，W及对其当前健康状况的评估，有助于糖尿病并发结直肠癌的 早期预警、早诊早治、预后评估。
[0018] 目前国内外尚未见关于高血糖状态并发结直肠癌的特异性分子标志物的报道。
[0019] 本研究组收集了 391名结直肠癌患者的初入院空腹血糖值，统计不同血糖水平结 直肠癌患者所占百分比，并析不同血糖水平与临床病理参数的相关性。我们发现，高血糖并 发的结直肠癌患者高达29. 67%，高血糖并发结直肠癌的患者肿瘤直径更大、分化程度更差， 提示血糖水平可明显影响结直肠癌患者的肿瘤恶性程度及进展程度。
[0020] 本研究组采用Illumina Hiseq第二代测序平台对并发及不并发高血糖的结直肠 癌肿瘤组织及正常肠组织样本分别进行了高通量转录组测序，通过信息学分析后，初步筛 选了一批在糖尿病并发结直肠癌组织中表达量具有显著差异的分子标志物。为进一步验证 上述筛选的分子标志物对于高血糖并发结直肠癌病程及预后评估的可靠性，我们收集了大 样本量（120例)临床结直肠癌样本，检测其初入院时清晨空腹血糖水平，根据血糖水平及良 恶性分类后，进一步验证了高血糖并发结直肠癌分子标志物的mRNA水平。
[0021] 我们的验证结果发现，癌胚抗原相关细胞粘附分子-5 (Carcinoemb巧onic Antigen-related Cell A 化 esion Molecule 5，CEACAM5)在并发高血糖的结直肠癌患者 肿瘤组织中的表达水平显著高于并发高血糖结直肠癌患者的正常肠组织，在正常血糖的结 直肠癌患者肿瘤组织中的表达水平显著高于正常血糖的结直肠癌患者正常肠组织。而在正 常肠粘膜细胞及健康人群外周血中不表达或低表达。我们认为CEACAM5在高血糖状态下并 发结直肠癌的发生发展中具有较高的特异性及灵敏性，可W作为糖尿病并发结直肠癌的标 志物之一。
[0022] CEACAM5是在细胞表面和细胞膜中形成的分子量为180 kDa跨膜糖蛋白，是癌胚 抗原亚型，其与细胞黏附有关。CEACAM 5为免疫球蛋白超家族的重要成员，属于细胞表面糖 蛋白，通过糖基磯脂醜肌醇连接在细胞膜上。CEACAM 5分布在上皮细胞和血管内皮细胞上， 在致癌因子的诱导下，CEACAM 5的表达可W升高，引起肿瘤细胞的增生和细胞增殖活性的 提高。CEACAM5在50%的肿瘤中是升高的，在肿瘤组织中比在正常组织中平均高60到100 倍，被认为有癌基因的功能。CEACAM 5在肿瘤组织中的过表达可W促进肿瘤的血管生成， 与癌细胞侵袭性的生物行为相关，还与耐受失巢调亡现象相关，CEACAM 5的高表达可破坏 细胞极性和正常组织结构，阻碍多种细胞的分化成熟，可能导致肿瘤发生。CEACAM 5高表达 时引起强烈的炎性反应、促进肿瘤侵袭、生长及淋己结转移。因此检测CEACAM 5的表达可 能对判断结直肠癌的预后有一定价值。
[0023] 综上所述，本发明具有W下有益效果： 1、 本发明产品将通过检测高血糖状态人群外周静脉血清样本中CEACAM5 mRNA表达水 平，可用于评估高血糖人群并发结直肠癌的易感性及预后，有助于糖尿病并发结直肠癌患 者的早期预警、早诊早治、预后评估，对于降低我国糖尿病、结直肠癌的高发病率、高致死率 具有重大的应用价值； 2、 本发明建立了利用特异性引物检测外周静脉血清CEACAM5 mRNA的方法；由于本方 法采用了定量PCR扩增技术，使得检测CEACAM5 mRNA的敏感性大大提高，能保证在极少的 标本中获得足够的信息； 3、 本发明还提供了作为阳性对照(标准品)的含有高表达CEACAM5基因的cDNA模板(体 积 2y L);标准品碱基序列为；CTACTTGTCCACAATCTGCCCCAGCATCTTTTTGGCTACAGCTGGTACAAAG GTGAAAGAGTGGATGGCAACCGTCAAATTATAGGATATGTAATAGGAACTCAACAAGCTACCCCAGGGCCCGCATAC AGTGGTCGAGAGATAATATACCCCAATGCATCCCTGCTGATCCAGAACATCATCCAGAATGACACAGGATTCTACAC CCTACACGTCATAAAGTCAGATCTT ； 4、 本发明还提供了作为阴性对照的不表达或低表达CEACAM5基因的cDNA模板(体积 2y LX
【附图说明】
[0024] 图1显示的是本发明血清样本提取总RNA琼脂糖凝胶电泳； 图2显示的是本发明Agilent 2100芯片检测样本1的RNA样品完整性； 图3显示的是本发明Agilent 2100芯片检测样本2的RNA样品完整性； 图4显示的是本发明CEACAM5 mRNA扩增动力学曲线； 图5显示的是本发明GAPDH mRNA扩增动力学曲线； 图6显示的是本发明CEACAM5 mRNA的相对表达量。
【具体实施方式】
[00巧]下面结合实施例对本发明进一步说明。但应明确，本文上述说明W及下述实施例 仅是用作举例说明，并不构成对本发明范围的限制。
[0026] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[002引引物设计和合成 1. 1 CEACAM5基因引物设计与合成 拟扩增的CEACAM5基因标准品序列为CEACAM5基因第1、2外显子区183-347碱 基，W CEACAM5全长mRNA序列为模板设计引物。标准品PCR上游引物F序列为： 5, -CAGCCTCACTTCTAACCTTC-3,；下游引物 R 序列为；5, -TGCCATCCACTCTTTCAC-3，。
[0029] 1.2 GAPDH基因引物设计与合成 拟扩增的内参照基因人类甘油酵-3-磯酸脱氨酶（GAPDH)序列为GAPDH基因第6、7外 显子区1065-1174碱基，W GAPDH长mRNA序列为模板设计引物，GAPDH基因上游引物F序列 为；5' -CACCCAC TCCTCCACCTTTG-3' ；下游引物 R 序列为；5' - CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。
[0030] 2.含有高表达CEACAM5基因的cDNA模板、不表达或低表达CEACAM5基因的cDNA 模板制备方法： 2. 1有关试剂的配制： (1) DEPC水配制方法： 在1000血的双重蒸觸水（dd&O)中加入ImLDEPC原液，磁力揽拌器揽拌过夜。
[0031] (2) 1 mol/L Tris.CKpH =8. 0)配制方法；800 血蒸觸水中溶解 121. 1 g Tris， 加浓肥1调抑至8. 0,定容至1 L，高压灭菌备用。
[0032] (3) 50XTAE缓冲液配制方法；500血双蒸水中溶解242 g Tris，加入100血0. 5 mol/L邸TA (pH =8. 0)、57. 1血冰己酸，定容至1 L，室温保存备用。
[0033] 2. 2血清总RNA的提取 (1) W邸TA-K2抗凝真空负压采血管收集特定人群1、特定人群2的清晨空腹外周静脉 血各5ml (分别为样本1、样本2)，置于冷冻离也机中，4°C下调整转速2500-3000 r/min，离 也8-lOmin后用无菌吸管吸取血清2 ml~3ml ; (注：特定人群1 :高血糖并发结直肠患者：该类患者在未使用降糖药的情况下年平 均空腹血糖水平八.77mmol/L、肿瘤组织在手术切除后经病理科确诊为结直肠癌；特定人 群2 ;糖尿病(未并发肿瘤病）患者；该患者在未使用降糖药的情况下月平均空腹血糖水平 〉7. 77mmol/L、经超声影像学/肠镜活检病理检查无结直肠肿瘤者） (2) 将上述血清加入含有ImL Trizol的匀浆管中，于匀浆机匀浆20sec，立即放于冰 上； (3) 置于超净台中，温育5min，12000r/min，离也lOmin ; (4) 吸上清于新的1.5血离也管中，加入200UL的氯仿，摇匀，室温静置2min，4°C， 12000;r/min，离也 lOmin ; (5) 吸取上清于新的1.5血离也管中，加入600 uL的异丙醇，混合均匀，室温静置 15min，4°C，12000r/min，离也 15min,弃上清； (6) 加入1血75%的无水