组引物组合。
[0016]图3为DNA聚合酶用量优化图谱，M:DL2000 DNA分子量标准；1_4依次为'2.5、4、5、6U。
[0017]图4为退火温度优化图谱，M:DL2000 DNA分子量标准；1_11依次为:52°C -62°C。
[0018]图5为一步法多重RT-PCR特异性和稳定性电泳图谱，M:DL2000 DNA分子量标准；I:RGDV ；2:RRSV ；3:SRBSDV ；4:RBSDV ；5:RGDV+RRSV ；6:RGDV+SRBSDV ；7:RGDV+RBSDV ；8:RRSV+SRBSDV ；9:RRSV+RBSDV ；10:SRBSDV+RBSDV ；11:RGDV+RRSV+SRBSDV ；12: RGDV+RRSV+RBSDV ；13:RGDV+SRBSDV+RBSDV ；14:RRSV+SRBSDV+RBSDV ；15:RGDV+RRSV+SRBSDV+RBSDV ；16:阴性对照。
[0019]图6为一步法多重RT-PCR灵敏度分析电泳图谱，M:DL2000 DNA分子量标准；1_6:5-0、5-1、5-2、5-3、5-4、5-5、5-6。
[0020]图7为随机采取的田间样品进行多重一步法RT-PCR电泳图谱，M:DL2000 DNA分子量标准；1_14:为田间随机采取的样品；15:四种病毒RNA混合物；16:阴性对照。
【具体实施方式】
[0021]为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0022]本发明针对我国水稻病害的发生现状，设计特异的引物，探索和优化多重PCR反应体系的参数，建立了能够从水稻样品中同时检测RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV四种病毒复合侵染的多重PCR检测方法，该方法具有检测时间短，成本低，特异性强等优点。
[0023]本发明的同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测过程为:
样品米集
水稻样品来自广东省的广州、罗定、郁南、遂溪、南雄、曲江、河源、龙川、梅县、博罗、阳东、信宜、高州、汕尾等地方，随机选取取了 14株样品进行实验。
[0024]样品RNA的提取
分别剪取病害症状明显的水稻叶片约0.2g，液氮研磨后加入800 μ I Trizol和400 μ I的氯仿:异戍醇(24:1)后转入2.0ml离心管润旋混勻；4°C下12000rpm离心15min,取上清液于新的1.5ml离心管中加入等体积的预冷的异丙醇，轻轻混匀后置于_20°C下20min ;然后4°C下12000rpm离心1min,弃上清；
加入75%的预冷的乙醇(DEPC处理)，4°C下7500rpm离心5min，室温晾干沉淀后加入10ul无RNase的水溶解，_20°C保存备用或继续下游实验。同时以健康水稻总RNA为阴性对照，提取方法同上。
[0025]RT-PCR 扩增
按照 One Step RT-PCR Kit (TaKaRa)说明书，PCR 反应体系为:2X I step buffer10.0ul, RGDV、RRSV、SRBSDV 和 RBSDV 引物的终浓度依次为:0.2、0.125,0.125 和 0.25umol/L, PrimeScript I step Enzyme Mix (5U/ul) 2.5U，退火温度为 58°C, RNA 模板为
1.0ul，最后补水至20ul。
[0026]PCR 反应参数为:50°C反转录 30min，94°C预变性 2min ;然后 94°C 30s, 58°C 30s，72°C lmin，共35个循环；最后在72°C延伸lOmin，降温至10°C结束反应。
[0027]PCR产物电泳检测
取6ul PCR产物与Iul 6 X loading buffer相混合,室温下进行1.2%琼脂糖凝胶(已加入goldview核酸染料)电泳，电泳条件为电压100V,时间40min,电泳结束后于凝胶成像系统观察电泳结果。电泳结果见说明书附图7。
[0028]实现本发明的具体步骤如下:
引物设计
依据NCBI中GenBank公布的序列，下载病毒基因组序列，然后对下载的序列进行同源比对，以RGDV S8、RRSV S8、RBSDV S6和SRBSDV SlO为模板，设计特异引物，利用BLAST在线软件检测特异引物，四种病毒的引物具体如下:
水稻瘤矮病毒的引物为:
上游引物:5 ’ -GTACTCAGACCTGAACGTAGT-3，
下游引物:5’ -CTCAATAGCGATCGCATACC-3’
水稻齿叶矮缩病毒的引物为:
上游引物:5 ’ -CGCCGTATCTAACGTTCCAG-3’
下游引物:5’ -TGCCGCGACATAATCAAC-3’
南方水稻黑条矮缩病毒的引物为:
上游引物:5 ’ - CGCGTCATCTCAAACTACAG-3 ’
下游引物:5’ -TTTGTCAGCATCTAAAGCGC-3’
水稻黑条矮缩病毒的引物为:
上游引物:5 ’ -AATGCCACTTGCCAGTTACG-3，
下游引物:5’ -GCTACTTCGTCAGTTAGATC-3’。
[0029]2、样品总RNA的提取
(O分别剪取病害症状明显的水稻叶片约0.2g，液氮研磨后加入800 μ I Trizol和400 μ I的氯仿:异戊醇(24:1)后转入2.0ml离心管涡旋混匀；
(2)4°C下12000rpm离心15min,取上清液于新的1.5ml离心管中加入等体积的预冷的异丙醇，轻轻混匀后置于_20°C下20min ；
(3)然后4°CT 12000rpm 离心 1min,弃上清；
(4)加入75%的预冷的乙醇(DEPC处理)，4°C下7500rpm离心5min，室温晾干沉淀后加入10ul无RNase的水溶解，_20°C保存备用或继续下游实验。同时以健康水稻总RNA为阴性对照，提取方法同上。
[0030]3、单重 RT-PCR 检测
3.1 一步法RT-PCR扩增
按照One Step RT-PCR Kit(TaKaRa)说明书，稍作修改，PCR反应体系为:20ul反应体系中，2X1 step buffer 10.0ul, PrimeScript I step Enzyme Mix 0.5ul, RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV各Iul上下游引物混合物(各10umol/L)和1.0ul RNA模板，最后补水至20ul。
[0031]PCR 反应参数为:50°C反转录 30min，94°C预变性 2min ;然后 94°C 30s, 55°C 30s，72°C lmin，共35个循环；最后在72°C延伸lOmin，降温至10°C结束反应。
[0032]3.2 PCR产物电泳检测
取6ul PCR产物与Iul 6 X loading buffer相混合,室温下进行1.2%琼脂糖凝胶(已加入goldview核酸染料)电泳，电泳条件为电压100V,时间40min,电泳结束后于凝胶成像系统观察电泳结果。
[0033]3.3电泳结果分析
分别得到RGDV、RRSV, SRBSDV和RBSDV的扩增条带，依次约为244bp、397bp、682bp和lOOObp，其大小与理论值相符，结果见说明书附图1。
[0034]4、四重 RT-PCR 优化
4.1引物浓度比例的优化设置了4个引物浓度组合:
第一组:RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各1umo I/L)均为0.125umol/L ；
第二组:RGDV、RRSV, SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各10umol/L)分别为0.2、0.125,0.125 和 0.25umol/L ；
第三组:RGDV、RRSV, SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各10umol/L)分别为0.2、
0.125,0.125 和 0.3umol/L ；
第四组:RGDV、RRSV, SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各10umol/L)分别为0.25、
0.25,0.25 和 0.3umol/L ；
按照单重RT-PCR检测方法，进行多重RT-PCR反应，电泳结果见说明书附图2。
[0035]4.2 DNA聚合酶用量的优化
对Taq DNA聚合酶(5U/ul)的用量设为四个梯度:2.5U、4U、5U和6U四个梯度，按照单重RT-PCR检测方法，进行多重RT-PCR反应，电泳结果见说明书附图3。
[0036]4.3退火温度的优化
最后对退火温度进行优化，从52°C到62°C每1°C为一个梯度，按照单重RT-PCR检测方法，进行多重RT-PCR反应，电泳结果见说明书附图4。
[0037]4.4四重RT-PCR特异性和稳定性
根据上述优化结果，多重PCR最佳反应体系为:2X1 step buffer l0.0ul，RGDV,R