RSV、SRBSDV 和 RBSDV 引物的终浓度依次为:0.2,0.125,0.125 和 0.25 umol/L,PrimeScript I step Enzyme Mix 2.5U，退火温度为 58°C, RNA 模板为 1.0ul,最后补水至 20ul。PCR 反应条件为:50°C 反转录 30min，94°C预变性 2min ;然后 94°C 30s, 58°C 30s，72°C lmin，共35个循环；最后在72°C延伸lOmin，降温至10°C结束反应。
[0038]具体地，取多份RGDV、RRSV, SRBSDV和RBSDV四种病毒的RNA样品，按照单一病毒模板(4种)、两种病毒随机组合的复合模板(6种)、三种病毒随机组合的复合模板(4种)以及四种病毒复合模板(I种)的方式配制成15种不同的检测样品，健康水稻总RNA作为阴性对照，采用上述优化的条件，对其进行检测并重复实验。电泳结果见说明书附图5。
[0039]5、四重RT-PCR灵敏度分析
取浓度相当的四种病毒总RNA等体积混合在一起作为复合模板，测其含量后作5倍梯度稀释，共7个浓度梯度(5-0-5-6)，采用4.4优化的方法，进行多重PCR扩增以检测其敏感性，电泳结果见说明书附图6。
[0040]利用本发明的方法可以大量检测水稻样品，建立了能够从水稻样品中同时检测RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV四种病毒复合侵染的多重PCR检测方法，本发明的同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法能有效的检测水稻4种病毒，快速准确，稳定性好，特异性强，避免了 PCR的重复检测，减少了工作量，实现了水稻多种病毒的高效快速检测，有利于研究田间4种病害的发生程度，在农业生产上具有重要的指导意义，为制定科学的病虫害防控体系提供了理论依据。
[0041]最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
【主权项】
1.一种同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法，四种病毒为水稻瘤矮病毒(RGDV)，水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)，南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV )，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一，扩增引物的设计； 步骤二，样品总RNA的提取； 步骤三，单重RT-PCR检测； 步骤四，四重RT-PCR优化； 步骤五，四重RT-PCR的灵敏度分析； 其中，步骤一中先下载病毒基因组序列，然后对下载的序列进行同源比对，以RGDV S8、RRSV S8、RBSDV S6和SRBSDV SlO为模板，设计特异引物，利用BLAST在线软件检测特异引物，四种病毒的引物具体如下: 水稻瘤矮病毒的引物为: 上游引物:5 ’ -GTACTCAGACCTGAACGTAGT-3， 下游引物:5’ -CTCAATAGCGATCGCATACC-3’ 水稻齿叶矮缩病毒的引物为: 上游引物:5 ’ -CGCCGTATCTAACGTTCCAG-3’ 下游引物:5’ -TGCCGCGACATAATCAAC-3’ 南方水稻黑条矮缩病毒的引物为: 上游引物:5 ’ - CGCGTCATCTCAAACTACAG-3 ’ 下游引物:5’ -TTTGTCAGCATCTAAAGCGC-3’ 水稻黑条矮缩病毒的引物为: 上游引物:5 ’ -AATGCCACTTGCCAGTTACG-3， 下游引物:5’ -GCTACTTCGTCAGTTAGATC-3’。
2.根据权利要求1所述的同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法，其特征在于，步骤二中的具体步骤如下: (O分别剪取病害症状明显的水稻叶片约0.2g，液氮研磨后加入800 μ I Trizol和400 μ I的氯仿:异戊醇后转入2.0ml离心管涡旋混匀，其中，氯仿:异戊醇=24:1 ; (2)4°C下12000rpm离心15min,取上清液于新的1.5ml离心管中加入等体积的预冷的异丙醇，轻轻混匀后置于_20°C下20min ； (3)然后4°CT 12000rpm 离心 1min,弃上清； (4)加入75%的预冷的乙醇，4°C下7500rpm离心5min,室温晾干沉淀后加入10ul无RNase的水溶解，_20°C保存备用或继续下游实验。
3.根据权利要求1所述的同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法，其特征在于，步骤三中的单重RT-PCR检测包括以下步骤: (I)一步法RT-PCR扩增:PCR反应体系为:20ul反应体系中，2X1 step buffer10.0ul，PrimeScript I step Enzyme Mix 0.5ul，RGDV、RRSV、SRBSDV 和 RBSDV 各 Iul 上下游引物混合物和1.0ul RNA模板，最后补水至20ul ； PCR 反应参数为:50°C反转录 30min，94°C预变性 2min;然后 94°C 30s, 55°C 30s, 72°Clmin，共35个循环；最后在72°C延伸lOmin，降温至10°C结束反应； (2)PCR产物电泳检测:取6ul PCR产物与Iul 6X loading buffer相混合，室温下进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为电压100V，时间40min，电泳结束后于凝胶成像系统观察电泳结果； (3)电泳结果分析:分别得到RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV的扩增条带，依次约为244bp、397bp、682bp和lOOObp，其大小与理论值相符。
4.根据权利要求3所述的同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法，其特征在于，步骤四的四重RT-PCR优化包括以下步骤: (O引物浓度比例的优化:设置了 4个引物浓度组合: 第一组:RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各1umoI/L)均为0.125umol/L ； 第二组:RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各10umol/L)分别为0.2、0.125,0.125 和 0.25umol/L ； 第三组:RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各10umol/L)分别为0.2、0.125,0.125 和 0.3umol/L ； 第四组:RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各10umol/L)分别为0.25、0.25,0.25 和 0.3umol/L ； 按照单重RT-PCR检测方法，进行多重RT-PCR反应； (2)DNA聚合酶用量的优化JfTaqDNA聚合酶的用量设为四个梯度:2.5U、4U、5U和6U四个梯度，按照单重RT-PCR检测方法，进行多重RT-PCR反应； (3)退火温度的优化:最后对退火温度进行优化，从52°C到62°C每1°C为一个梯度，按照单重RT-PCR检测方法，进行多重RT-PCR反应。
5.根据权利要求4所述的同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法，其特征在于，在步骤四中，根据优化的结果，多重PCR最佳反应体系为:2X1 step buffer l0.0ul，RGDV、RRSV、SRBSDV 和 RBSDV 引物的终浓度依次为:0.2、0.125,0.125 和 0.25 umol/L,PrimeScript I step Enzyme Mix 2.5U,退火温度为 58°C, RNA 模板为 1.0ul,最后补水至20ul ;最后PCR反应条件为:50°C反转录30min，94°C预变性2min ;然后94°C 30s, 58°C30s, 72°C lmin，共35个循环；最后在72°C延伸lOmin，降温至10°C结束反应。
6.根据权利要求1所述的同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法，其特征在于，步骤五中，取浓度相当的四种病毒总RNA等体积混合在一起作为复合模板，测其含量后作5倍梯度稀释，共7个浓度梯度，采用步骤四中优化的方法，进行多重PCR扩增以检测其敏感性。
【专利摘要】本发明公开了一种同时检测水稻四种病毒的多重PCR方法，通过对水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus，RGDV）、水稻齿叶矮缩病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV）、南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）和水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）的引物浓度、酶的用量和PCR扩增条件等的优化，建立了一种同时检测水稻四种病原的方法。本方法主要包括以四种病毒基因序列为模板设计特异扩增引物；样品总RNA的提取；四重PCR优化；PCR扩增产物的凝胶电泳检测及结果分析。本发明实现了对田间复合侵染的水稻样品的快速检测，检测结果可靠、准确、特异性强，并缩短了检测时间，有利于研究田间4种病害的发生程度，在农业生产上具有重要的指导意义，为制定科学的病虫害防控体系提供了理论依据。
【IPC分类】C12Q1-70, C12R1-93, C12Q1-68
【公开号】CN104651537
【申请号】CN201510105768
【发明人】周国辉, 杨新
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月11日