勾后于26°C的培养箱中培养，分别在18 h和24 h后观察孢子的萌发情况。结果如图5~8所示，其中图5为对照组处理18 h，图6为对照组处理24 h，图7为Bbafp实验组处理18h，图8为Bbafp实验组处理24 h，图5~8中标尺均为0.01 mm ;试验结果显示，Bbafp会抑制白菜黑斑菌孢子的萌发，并导致萌发孢子的畸形。
[0038]二、Bbafp的植物遗传转化:
实施例5 Bbafp植物表达载体的构建:
为分析Bbazf是否能提高植株的抗病能力，构建Bbafp的植物表达载体。以野生型球孢白僵菌(CGMCC7.34，中国普通微生物菌种保藏管理中心)的cDNA为模板(植物病原真菌胁迫处理)，引物 PBbafp-pexl 和 PBbafp-pex2，(PBbafp-pexl: cgggatccatgcagattatttccatcgc ；PBbafp-pex2: cggaattcctagtggcacacgacagctc,其中，PBbafp-pexl 的下划线序列为BamHI序列，PBbafp-pex2的下划线序列为EcoRI序列)扩增出Bbafp的全长核苷酸片段(包括其N端的信号肽序列)；
PCR 反应体系:2.5 μ? 1XLA buffer, 2 μ? dNTP Mix, 2.5 μ? 25 mmol/L 的 MgCl2S液，10 Mmol/L 的 PBbafp-pexl 和 PBbafp_pex2 各 I μ?，0.2 μ? LA Taq DNA 聚合酶，I μ?cDNA模版，加水补至总体积为25 μι;所述LA Taq DNA聚合酶为5 U/uL;所述dNTP Mix为dATP, dCTP、dGTP和dTTP的钠盐水溶液预混合的产品，其中，四种物质在dNTP Mix中的浓度均为2.5 mmol/L ;PCR反应参数为:95°C预变性5 min;94°C变性30 s，56°C退火30 sec，72°C延伸I min，32个循环；最后72°C延伸5 min ；
扩增反应后，回收Bbafp片段，并克隆进pEASY-Tl载体，获pEASY-fBbafp。测序结果显示，所获目标基因与预期完全一致，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，氨基酸序列如SEQID N0.2 所示。
[0039]BamHI与EcoRI酶切pEASY-fBbafp，回收Bbafp片段，克隆进本发明优选的经相同BamHI与EcoRI酶切的植物表达载体pCambia，获得pCambia-35s_Bbafp (图9)。其中，GRP-GusPlus-His6代表⑶SPlus报告基因，该基因在N端融合了 GRP信号肽，在C端融合了His6序列标签；NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性！Nosterm:Nos终止子；CaMV 35S:来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB:T-DNA左边界；RB:T-DNA右边界(图9)。
[0040]利用电击法将pCambia-35s_Bbafp转入根癌农杆菌LBA4404感受态，验证获得Bbafp的农杆菌转化子，并用于下一步的番前遗传转化子。
[0041]实施例6番茄的遗传转化:
番茄遗传转化用培养基:
基本培养基:MS无机+B5有机+30 g/L蔗糖，pH5.8。固体培养基加入2 g/L的Gelrite(固化剂)(Murashige和Skoog，1962 ；Gamborg等，1968);上述浓度均为所述物质在配制好的培养基中的质量浓度；
共培养培养基:MS无机+B5有机+30 g/L蔗糖(pH5.8)+2.0 mg/L 6-BA (6-苄氨基嘌呤)+0.2 mg/L NAA (卩引噪乙酸)+100 umol/L AS (乙酰丁香酮)+2 g/L 的 Gelrite ;上述浓度均为所述物质在配制好的培养基中的质量浓度或摩尔浓度；
筛选培养基:MS无机+B5有机+30 g/L蔗糖(pH5.8)+2.0 mg/L 6-BA (6-苄氨基嘌呤)+0.2 mg/L NAA (吲哚乙酸)+100 umol/L AS(乙酰丁香酮)+500 mg/L cb (羧苄青霉素)+ 75 mg/L Km (卡那霉素)+2 g/L的Gelrite ;上述浓度均为所述物质在配制好的培养基中的质量浓度或摩尔浓度；
继代培养基:MS 无机+B5 有机+30 g/L 蔗糖(pH5.8)+200 mg/L cb+ 75 mg/L Km+2 g/L的Gelrite ;上述浓度均为所述物质在配制好的培养基中的质量浓度；
生根培养基:MS无机+B5有机+30 g/L蔗糖(pH5.8)+200 mg/L Cef (头孢噻肟钠)+50mg/L Km+2 g/L的Gelrite ;上述浓度均为所述物质在配制好的培养基中的质量浓度。
[0042]( I)转化用农杆菌浸染液的制备:
挑取实施例6制备的含pCambia-35s_Bbafp载体的根癌农杆菌菌株单菌落，接种于10 mL YEB (5 g/L蔗糖，I g/L细菌用酵母抽提物，10 g/L细菌用胰化蛋白胨，0.5 g/LMgSO4.7Η20，ρΗ7.0 ；50 mg/L Km, 125 mg/L Sm (链霉素)，上述浓度均为所述物质在YEB中的质量浓度)中，于28°C、200 rpm/min培养过夜，然后按5%体积比例将菌液接种入20 mL不含抗生素的液体YEB中，于28°C、200 rpm/min培养至0D600约为0.5 ;再取5 mL菌液于6000 rpm/min离心5 min，倾去上清液，用10 mL MSBO (基本培养基)液体培养基重悬菌体，重悬菌液即为浸染外植体的农杆菌浸染液。
[0043](2)番前遗传转化:
参考Cortina等(Plant Cell,Tissue and Organ Culture，2004，76 (3): 269 - 275)的方法，以生长约10天无菌苗的子叶为外植体，利用根癌农杆菌介导法进行遗传转化。
[0044]具体操作为:番茄种子用质量浓度为1%的次氯酸钠溶液消毒10-15 min，再用无菌自来水冲洗5-6次后，在25°C下，用16 h光照/8 h黑暗的光周期，于固体MSBO (基本培养基)中萌发约10 d，生长健壮的无菌幼苗子叶作为农杆菌介导遗传转化的外植体。用步骤(I)制得的农杆菌浸染液浸染外植体10 min后倾去菌液，用无菌吸水纸吸去外植体表面多余菌液，然后接种入铺有一层无菌滤纸的共培养培养基MSBl，25°C暗共培养2 d?共培养完成后，将外植体接种入筛选培养基MSB2中进行分化培养，在25°C下，用16 h光照/8 h黑暗的光周期，培养2周；然后将外植体继代入MSB3 (继代培养基)培养基诱导愈伤生成，每2周继代一次；待产生Km抗性幼芽后，将幼芽切下接种入MSB4生根培养基，获得Km抗性再生植株。根长3-5cm的再生幼苗，移栽入温室生长成苗。
[0045]最终，获得24株番茄幼苗。⑶S染色结果显示，22株为阳性，仅有两株为阴性，图10为⑶S染色结果。进一步利用PCR技术对番茄植株进行验证。引物为PBbafp-pexl和PBbafp-pex2，采用标准的PCR扩增程序，PCR结果如图11所示，图中1_17为不同的番茄植株，3为阴性植株，结果显示仅有3号没有扩增出目标条带，其余植株均有预期大小的目标条带。
[0046]实施例7转基因番茄叶片抗病性分析按照下述方法分析转基因番茄叶片的抗病性:
I)将番茄早疫病菌接种于PDA平板，于26°C培养10 d，待菌体长满整个平板，用紫外光连续照射上述平板三个晚上诱导产孢；用0.5%的吐温80配制番茄早疫病菌孢悬液，浓度约为 15个 /mL。
[0047]2)取新鲜的Bbafp转基因番茄叶片和野生型番茄叶片，将上述孢悬液均匀喷洒在叶片上；同时，用吸饱水的吸水纸包住叶柄部位；将处理后的叶片置于塑料筐中，并覆盖上一层透明薄膜以保持湿度，将塑料筐置于28°C温室中，每隔24 h观察叶片发病情况。
[0048]试验结果如图12所示，