n，45个循环；再于72°C延伸5min;
[0041] 步骤2)的反应条件为；37°C保温40min，再于85°C反应5min。
[0042] 步骤3)所述的单碱基延伸反应条件为；94°C预变性30S;延伸40个循环，每个循 环的条件为；94°C变性5s，52°C退火5S+80°C延伸5s共5次；再于72°C继续延伸3min。
[00创亚甲基四氨叶酸还原酶单核巧酸多态位点MTHFRC677Trsl801133、MTRRA1298化S1801131、酸甲硫氨酸合成酶还原酶MTRRA66Grsl801394单独或协同作用时， 与叶酸代谢能力相关。检测该些位点能揭示受检者在遗传方面叶酸代谢能力的高低，进而 给予具有个性化的膳食建议，使得受检者维持在良好的健康水平。
[0044] 上述方法和试剂盒有助于评估叶酸代谢能力水平，有针对性提供叶酸服用方案， 有效进行产品早期干预。本发明技术方案的优点有：敏感性较高；直接检测分子量，不需要 巧光标记；检测结果更直接准确；成本低。使用普通引物且可进行多重检测。完成同样数量 的祀标检测；对临床样品需求量较低。
【附图说明】
[0045] 图1为使用对照组1和2的PCR引物和单碱基延伸引物进行检测，所获得的 Massarray分型图。其中a为对照组1，b为对照组2。
[0046] 图2为使用如SEQIDNo. 1~9的PCR引物和单碱基延伸引物进行检测，所获得 的Massarray分型图。
【具体实施方式】
[0047] 实施例1
[0048]使用WizardGenomicDNApurificationKit(Promega)或NucleoSpin Tissue(MN)等试剂盒或类似产品提取受检者组织、细胞、血样或口腔粘膜中的DM,用分光 光度计定量，并用琼脂糖凝胶电泳质检。基因组DM电泳条带通常不小于20化，DNA浓度 〉1化g/y以0〇26(|/〇〇28(|〉1. 7，取电泳条带明亮清晰无拖带的样本进行后续操作。质检合格的 DNA将浓度调整到50ng/mU转移至384孔板，-20°C储存备用。
[0049] 实施例2
[0050] 1.分别使用如表1中所设计的PCR引物及单碱基延伸引物（SEQIDNo. 1~9)， 并用Sequenom公司GenotypingTool及MassARRAYAssayDesi即软件设计2套引物作为 平行对照（SEQIDNo. 10~21)，针对SNP位点利用设计PCR引物及单碱基延伸引物（见表 1)。实验组及对照组1、2的各序列如表2。
[0化1]表1 [0化2]
【主权项】
1. 一种用于叶酸代谢能力评估的检测方法，其特征在于该方法检测rsl801131、 rsl801133和rsl801394中至少一种，包括如下步骤： 1) 以受检者样本DNA为模板，加入PCR扩增引物对以及单碱基延伸引物进行PCR扩增 反应； 用于检测rsl801131的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2所 示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQIDNo. 7所示； 用于检测rsl801133的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 3、SEQIDNo. 4所 示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQIDNo. 8所示； 用于检测rsl801394的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 5、SEQIDNo. 6所 示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQIDNo. 9所示； 2) 步骤1)的PCR扩增系统中加入SAP酶，消化PCR产物； 3) 步骤2)的反应产物进行单碱基延伸反应； 4) 步骤3)的单碱基延伸反应产物纯化后与质谱芯片共结晶，用飞行质谱法检测并分 型，检测目的基因的SNP位点。
2. 根据权利要求1所述用于叶酸代谢能力评估的检测方法，其特征在于步骤1)中， 对提取的受检者样本DNA进行分光光度计定量和琼脂糖凝胶电泳，DNA浓度>10ng/yL， 0D260/0D280>1. 7,取电泳条带明亮清晰无拖带的样本进行后续操作；优选的，步骤1)所述 的PCR扩增条件为：93~95°C预变性1.5~2. 5min;93~95°C变性25~35S，55~58°C 退火25~35s，70~73°C延伸45~75s，42~48个循环；再于70~73°C继续延伸4. 5~ 6min;再优选，步骤1)中，反应体系中模板DNA的含量为1~4ng/yL，各引物的含量为80~ 150mM〇
3. 根据权利要求1所述用于叶酸代谢能力评估的检测方法，其特征在于步骤2)所述的 反应条件为：36~38°C保温35~50min，再于83~88°C反应4. 5~6min。
4.根据权利要求1所述用于叶酸代谢能力评估的检测方法，其特征在于步骤3)所述 的单碱基延伸反应条件为：93~95°C预变性25~35S ;延伸36~45个循环，每个循环的 条件为：93~95°C预变性4~7s，50~53°C退火4~7S+78~83°C延伸4~7s共4~7 次；再于70~73°C继续延伸2. 5~4min。
5. 根据权利要求1所述用于叶酸代谢能力评估的检测方法，其特征在于步骤1)所述的 PCR扩增条件为：94°C预变性2min;94°C变性30S，56°C退火30s，72°C延伸lmin，45个循 环；再于72°C延伸5min; 步骤2)的反应条件为：37°C保温40min，再于85°C反应5min; 步骤3)所述的单碱基延伸反应条件为：94°C预变性30S;延伸40个循环，每个循环的 条件为：94°C变性5s，52°C退火5S+80°C延伸5s共5次；再于72°C继续延伸3min。
6. 根据权利要求1所述用于叶酸代谢能力评估的检测方法，其特征在于步骤4)中用树 脂纯化延伸反应产物，并且步骤4)中，利用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱进行分 析。
7. -种用于叶酸代谢能力评估的飞行质谱生物芯片，其特征在于该飞行质谱生物芯片 包括样品分析物和质谱芯片基质，并且样品分析物与所述质谱芯片基质共结晶； 所述样品分析物包括用于叶酸代谢能力评估的目的基因、PCR扩增引物和单碱基延伸 引物，所述目的基因对应的SNP位点包括rsl801131、rsl801133和rsl801394中的至少一 种； 用于检测rsl801131的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2所 示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQIDNo. 7所示； 用于检测rsl801133的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 3、SEQIDNo. 4所 示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQIDNo. 8所示； 用于检测rsl801394的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 5、SEQIDNo. 6所 示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQIDNo. 9所示。
8. -种用于叶酸代谢能力评估的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括用于检测 rsl801131、rsl801133和rsl801394中一种、两种或三种的PCR扩增引物及单碱基延伸引 物； 用于检测rsl801131的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2所 示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQIDNo. 7所示； 用于检测rsl801133的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 3、SEQIDNo. 4所 示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQIDNo. 8所示； 用于检测rsl801394的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 5、SEQIDNo. 6所 示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQIDNo. 9所示。
9. 一种用于叶酸代谢能力评估的试剂盒的使用方法，其特征在于，该方法包括以下的 步骤： 1) 以受检者样本DNA为模板，加入试剂盒中的PCR扩增引物对以及单碱基延伸引物进 行PCR扩增反应；所述的PCR扩增条件为：93~95°C预变性1. 5~2. 5min;93~95°C变性 25~35S，55~58°C退火25~35s，70~73°C延伸45~75s，42~48个循环；再于70~ 73°C继续延伸4. 5~6min; 2) 步骤1)的PCR扩增系统中加入SAP酶，消化PCR产物；反应条件为：36~38°C保温 35 ~50min，再于 83 ~88°C反应 4. 5 ~6min; 3) 步骤2)的反应产物进行单碱基延伸反应；条件为：93~95°C预变性25~35S;延伸 36~45个循环，每个循环的条件为：93~95°C预变性4~7s，50~53°C退火4~7S+78~ 83°C延伸4~7s共4~7次；再于70~73°C继续延伸2. 5~4min; 4) 步骤3)的延伸反应产物纯化后与质谱芯片共结晶，用飞行质谱法检测并分型，检测 目的基因的SNP位点。
10. 根据权利要求9所述的一种用于叶酸代谢能力评估的试剂盒的使用方法，其特征 在于，步骤1)所述的PCR扩增条件为：94°C预变性2min;94°C变性30S，56°C退火30s， 72°C延伸lmin，45个循环；再于72°C延伸5min; 步骤2)的反应条件为：37°C保温40min，再于85°C反应5min; 步骤3)所述的单碱基延伸反应条件为：94°C预变性30S;延伸40个循环，每个循环的 条件为：94°C变性5s，52°C退火5S+80°C延伸5s共5次；再于72°C继续延伸3min。
【专利摘要】本发明公开了一种用于叶酸代谢能力评估的飞行质谱生物芯片，包括样品分析物和质谱芯片基质，所述样品分析物与所述质谱芯片基质共结晶，所述样品分析物包括用于叶酸代谢能力评估的目的基因，PCR引物和单碱基延伸引物。本发明还公开了利用该芯片进行检测方法，包括提取受检者样本DNA；对样本DNA进行目的基因的PCR扩增和单碱基延伸形成样品分析物；所述样品分析物与质谱芯片基质共结晶，检测目的基因的SNP位点。针对该位点的基因芯片能揭示受检者在遗传方面叶酸代谢能力的高低，进而给予具有个性化的膳食建议，使得受检者维持在良好的健康水平。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104774944
【申请号】CN201510169415
【发明人】何文迪, 宋毅, 杨菲
【申请人】浙江博惠生物科技有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月10日