r>[0035] 本发明的人工生物粒子1中的MVP3的N末端与亮氨酸拉链4之间的连接子优选以 小的氨基酸1~6个直链状地连接而形成。形成连接子的氨基酸的个数为1~6个的任一 者的情况下，具有亮氨酸拉链4的人工生物粒子1也被表达出来，从表达量更多且得到的人 工生物粒子1均匀的观点出发，进而从亮氨酸拉链4的运动的自由度的观点出发，连接子优 选小的氨基酸3~6个直链状地连接而形成。作为构成连接子的氨基酸。例如可列举出： 甘氨酸、丙氨酸等侧链小的氨基酸。后述的本实验例中，示出了由3个或6个直链状的甘氨 酸形成了连接子的例子。
[0036] 亮氨酸拉链4为由约30个残基的氨基酸构成的a-螺旋2根以相互的亮氨酸残 基通过疏水键合而形成的卡盘样的基序。作为本发明中的亮氨酸拉链4,例如，对于来自于 酵母的转录活化因子GCN4的亮氨酸拉链、除此以外的来自于其他的蛋白质的亮氨酸拉链， 也可以没有特别限制地使用。其中，1991年，来自于酵母的转录活化因子GCN4的亮氨酸拉 链的X射线晶体结构在1.8人分辨率下确定，从原子水平知道了由33个残基的氨基酸构成 的肽通过相互的亮氨酸残基疏水键合，形成牢固的卷曲螺旋。因此能够适宜使用来自于酵 母的转录活化因子GCN4的亮氨酸拉链。
[0037] 利用这样的本发明的人工生物粒子，可以期待制成为能够有效地利用其内部空间 的DDS等所能够利用的微囊，通过本发明收量提高了一个数量级，与成本大幅降低相联系。 另外可以期待，将本发明的人工生物粒子作为基础，能够pH依赖地可逆地控制开闭的粒子 的开发推进。
[0038] 此处，图4为示意地表示将本发明的人工生物粒子1作为微囊应用时的图，图5为 示意地表示将本发明的人工生物粒子1作为微囊应用的DDS的一例的图。利用本发明的人 工生物粒子1存在如下可能性，例如：通过对MVP的N末端所带有的亮氨酸拉链导入半胱氨 酸残基，如图4所示，能够开发出在中性条件下利用二硫键形成稳定的卵型粒子、在酸性条 件下通过二硫键的开裂而像正好一分为二地割开鸡蛋那样打开的、pH依赖地能够可逆地控 制开闭的微囊。通过使用这样的微囊也可以考虑如下的DDS:例如，如图5所示，预先在酸性 条件下将药剂11加入至穹窿体2的内部空间，将其投与，从而通过靶细胞13的表面的特异 的抗原12与预先附着于穹窿体2的表面的抗体（Fab)的抗原抗体反应，微囊被吸收至靶细 胞13内，在核内体14内成为酸性条件而微囊打开，药剂11被释放。这样的本发明的人工 生物粒子由于在其内部有非常大的空间，所以可以认为有希望制成为基因治疗时的载体。
[0039] 另外，也可以考虑将本发明的人工生物粒子1制成为封入有化妆品等的成分、渗 透至肌肤的深处的微囊而利用等。
[0040] 另外，近年来，利用蛋白质复合体的内部空间作为铸模，使金属聚合，使聚合产物 规则地排列，从而制作成为极小半导体的基底的基板的技术等也被确立。现在使用铁蛋白 等球状蛋白质，然而还存在利用本发明的人工生物粒子1、使用穹窿体2这样的椭圆的粒 子，从而制成到目前为止没有的新型的基板的可能性。
[0041] 本发明还提供特征在于将亮氨酸拉链基因整合至MVP基因的N末端侧并使其表达 的、人工生物粒子1的制造方法。由此，实验例中如后所述，与使用了由野生型MVP(W-MVP) 形成的W-穹窿体的昆虫细胞的现有的表达系统相比较，能够以10倍以上这样格外高的收 率得到本发明的人工生物粒子1。亮氨酸拉链基因和MVP基因的碱基序列已经公知，通过 适宜组合现有已知的基因工程学手法，能够将亮氨酸拉链基因整合至MVP基因的N末端侧。 后述的实验例中示出了如下的例子：使从酵母的转录活化因子GCN4切出并纯化的亮氨酸 拉链基因的片段、与同样地切出并纯化的来自于大鼠的MVP基因的片段（通过后述的连接 子）连接。
[0042] 对于使在MVP基因的N末端侧整合亮氨酸拉链基因而成的基因表达的细胞，没有 特别的限制，可例示出：昆虫细胞、比昆虫细胞高等的生物的细胞。已知使用比昆虫细胞低 等的例如大肠菌时，存在不能良好地形成生物粒子的情况，优选使用本领域中通常使用的 昆虫细胞而表达。作为昆虫细胞的具体例，可例示出Sf9。所表达的人工生物粒子可以通过 现有已知的合适的方法进行纯化。
[0043] 本发明的人工生物粒子1的制造方法中，优选将MVP基因和亮氨酸拉链基因不通 过限制性内切酶位点而用编码连接子的基因连接。使用上述的来自于酵母的转录活化因子GCN4的亮氨酸拉链基因的片段、来自于大鼠的MVP基因时，如果使其连接，则存在其间残留 有EcoRI的位点（GAATTC)，阻碍穹窿体粒子的形成的可能性。在后述的实验例中，将EcoRI 位点置换为连接有3个残基或6个残基的为具有最小侧链的氨基酸的甘氨酸的Gly连接 子，之后在昆虫细胞中使之表达。具体而言，根据想要导入的连接子设计引物，PCR之后，使 纯化的片段夹在MVP基因的N末端与亮氨酸拉链基因之间地连接即可。
[0044] 需要说明的是，本发明的人工生物粒子1的制造方法中，亮氨酸拉链、连接子等优 选的是也如人工生物粒子1所述。
[0045] 以下，列举出实验例对本发明详细地进行说明，但是本发明不限定于此。
[0046] <实验例>
[0047] 〔1〕利用昆虫细胞Sf9的野生型MVP(W-MVP)的大量表达系统的构筑
[0048] 〔A〕克隆了W-MVP的重组杆状病毒（BacmidDNA)的调制
[0049] 按照以下的步骤进行作业。
[0050] (1)将来自大鼠肝脏的MVP(W-MVP)的DNA用EcoRI和SphI的限制性内切酶位点 导入至pFastBac载体。
[0051] (2)将得到的pFastBac在大肠菌（DH5a)中进行转化，接种至加入了氨节西林 (100yg/mL)的LB平板，在37°C下静置培养24小时。
[0052] (3)用接种环等挑取多个菌落，利用菌落PCR确认靶基因是否扩增。
[0053] (4)将上述（3)中能够确认到基因扩增的菌落接种至加入了氨苄西林（100yg/ mL)的LB液体培养基5mL中，37°C下振荡培养一晚。
[0054] (5)从培养了 一晚的大肠菌（DH5a)中，使用QIAGEN公司的QIApr印Spin MiniprepKit，对克隆了W-MVP的pFastBac进行纯化。
[0055] (6)将克隆了W-MVP的pFastBac0? 1yg加入至DHlOBac20yL，轻轻地混合之 后，在冰上静置20分钟。
[0056] (7)在42°C下进行1分钟热休克，在冰上静置2分钟之后，加入200yL的S0C培 养基，37°C下振荡培养4小时。
[0057](8)将上述（7)的培养液向加入了卡那霉素（50yg/mL)、庆大霉素（7yg/mL)、四 环素（10Ug/mL)、X-gal(100yg/mL)、IPTG(50yg/mL)的LB平板中接种 20yL，37°C下静 置培养24小时（培养至能够辨别有无菌落的显色（蓝色或白色）为止）。
[0058] (9)用接种环等挑取白色的菌落，接种至新的LB平板（与上述相同），37°C下静置 培养一晚之后，再次确认有无显色。
[0059] (10)将上述（9)中再确认的来自于白色的菌落的大肠菌（DH5a)接种至加入了 卡那霉素（50yg/mL)、庆大霉素（7yg/mL)、四环素（10yg/mL)的LB液体培养基5mL中， 37°C下振荡培养一晚。
[0060] (11)从培养了 一晚的大肠菌（DHlOBac)中，使用QIAGEN公司的QIApr印Spin MiniprepKit，对克隆了W-MVP的Bacmid进行纯化。Bacmid的尺寸非常大，所以进行纯化 时，洗脱缓冲液使用加温至70°C的缓冲液。
[0061] 〔B〕克隆了W-MVP的重组杆状病毒的增殖（病毒液的制作）
[0062] 在安全柜内，按照以下的步骤进行。
[0063] (1)将用Invitrogen公司的Sf900-II培养基（加入了 10%血清）培养中的Sf9 细胞（1.5-2.0\106细胞/1^)在1511^管内使用5€900-11培养基（加入了10%血清）进 行稀释，由此将浓度调制为1. 2X105细胞/mL。
[0064] (2)向12孔培养平板中加入调制成终浓度0.4X105细胞/mL的细胞培养液 lmL。加入上述的1.2X105细胞/mL的培养液300yL、Sf900-II培养基（加入了 10%血 清）700yL，总计设为lmL。
[0065] (3)在27°C下静置20分钟，使细胞粘附于细胞培养平板的底面。
[0066] (4)在 1. 5mL管内将Gracemediumunsupplement214yL、Cellfectin8yL、 Bacmid1yg混合，在安全柜内室温下放置30分钟（Cellfectin用祸流搅拌器搅拌10秒左 右后使用）。
[0067] (5)对于上述（3)中的12孔培养平板进行倒立显微镜观察，确认到细胞附着于容 器的底面，然后取出培养基（边将平板向里面倾斜边将盖以立在面前的方式放置，用移液 枪吸出）。
[0068] (6)取出培养基之后，用GracemediumunsupplementlmL进行清洗。扔掉清洗 液。
[0069] (7)之后，对细胞加入上述的Bacmid与Cellfectin的混合液。
[0070] (8)将12孔平板加入至密闭的Tupperware内，27°C下静置4小时。为了保持 Tupperware内的湿度，将用纯水润湿的多枚Kimwipe和含有lmL的0. 5MEDTA的物质置于 Tupperware的端部。
[0071] (9) 4 小时后，将Gracemediumunsupp