lement(加入了 10 %血清）400yL铺开， 27°C下进行培养2天。
[0072] (10)经过2天培养后，将培养液用1. 5mL的管转移，通过高速离心分离（4000Xg、 3分钟）下使细胞沉淀。由于上清是病毒液（P0)，所以将其转移至新的1.5mL的管中。病 毒液（P0)在贴有遮光膜的4°C的培养箱（chromatographychamber)内保存。
[0073] (11)向底面积25cm2的培养烧瓶中以细胞数成为3X10 6细胞的方式加入培养液 (总计设为5mL)。例如，用Sf900-II培养基（加入了 10%血清）培养中的Sf9细胞的细胞 数为IX106细胞/mL时，将向培养液3mL中加入Sf900-II培养基（加入了 10%血清）2mL 而成5mL的物质加入至培养烧瓶。
[0074] (12)在27°C下静置15分钟，使细胞粘附于细胞培养烧瓶的底面。
[0075] (13)加入P0的病毒液200yL，培养3天。
[0076] (14)经过3天培养后，在回收病毒液（P1)之前，向底面积75cm2的培养烧瓶中以 细胞数成为9X106细胞的方式加入培养液（总计成为15mL)。准备15mL的6X10 5细胞/ mL的培养液，总计的细胞数成为9X106细胞。
[0077] (15)在27°C下静置15分钟，使细胞粘附于细胞培养烧瓶的底面。
[0078] (16)在回收病毒液（P1)之前，从上述的底面积25cm2的培养烧瓶中，使用移液管 取出0.5mL的上清液，加入至上述（14)的培养液中（用于防止污染物）。之后，将培养液在 27°C下培养3天。
[0079] (17)将残留的培养液边用移液管吸取或排出，同时将附着于烧瓶底面的细胞剥 离，转移至15mL的管中，通过高速离心分离（4000Xg、3分钟）使细胞沉淀。由于上清成为 病毒液（PI)，所以将其转移至新的15mL的管中。作为沉淀落下的Sf9细胞在-80°C下冷冻 保存，用于表达检测。病毒液（P1)在贴有遮光膜的4°C的培养箱内保存。
[0080] (18)用底面积75cm2的培养烧瓶培养3天后，边用移液管吸取或排出培养液边将 附着于烧瓶底面的细胞剥离，转移至50mL的管中，以高速离心分离（4000Xg、3分钟）使细 胞沉淀。由于上清成为病毒液（P2)，所以将其转移至新的50mL的管中。作为沉淀落下的 Sf9细胞在-80°C下冷冻保存，用于表达检测。病毒液（P2)在贴有遮光膜的4°C的培养箱内 保存。
[0081] (19)在1L的旋转烧瓶中准备1X106细胞/mL的培养液300mL，加入病毒液 (P2)3mL(培养基的1%量），在27°C下培养3天。
[0082] (20)经过3天培养后，将培养液转移至离心管，通过高速离心分离（4000Xg、30分 钟）使细胞沉淀。由于上清为病毒液（P3)，所以将其转移至新的500mL的培养基瓶中。此 时使用的离心管、离心管的盖、培养基瓶预先用铝箔包裹，用高压釜进行灭菌。作为沉淀落 下的Sf9细胞在-80°C下冷冻保存，用于纯化。病毒液（P3)在贴有遮光膜的4°C的培养箱 内保存。
[0083] (21)在3L的旋转烧瓶中准备1X106细胞/mL的培养液500mL，加入病毒液 (P3)5mL(培养基的1%量），在27°C下培养3天。
[0084] (22)经过3天培养后，将培养液转移至离心管，通过高速离心分离（4000Xg、30分 钟）使细胞沉淀。由于上清为病毒液（P4)，所以将其转移至新的500mL的培养基瓶中。此 时使用的离心管、离心管的盖、培养基瓶预先用铝箔包裹，用高压釜进行灭菌。作为沉淀落 下的Sf9细胞在-80°C下冷冻保存，用于纯化。病毒液（P4)在贴有遮光膜的4°C的培养箱 内保存。
[0085] 〔2〕昆虫细胞Sf9的N末端附着有亮氨酸拉链的MVP(LZ-MVP)的大量表达系统的 构筑
[0086] 按照以下的顺序进行作业。
[0087] (1)将编码来自于酵母菌的GCN4(281氨基酸）的氨基酸序列（序列号1)第249 位的精氨酸至第281位的精氨酸为止的DNA(亮氨酸拉链基因）（包含BamHI和EcoRI的限 制性内切酶位点）（序列号2)(将表达的亮氨酸拉链的氨基酸序列示于序列号3)导入至 PromegaKK?的pGEM-T载体，使用QIAGEN公司的QIAprepSpinMiniprepKit，对克隆有 亮氨酸拉链的质粒进行纯化。将导入至pFastBac的亮氨酸拉链基因的碱基序列（包含限 制性内切酶位点（BamHI、EcoRI)、起始Met)示于序列号4,将被表达的亮氨酸拉链的氨基酸 序列示于序列号5。
[0088] (2)使用限制性内切酶BamHI和EcoRI从pGEM-T载体中切出亮氨酸拉链基因。
[0089] (3)同样地，对克隆了来自于大鼠的W-MVP的pFastBac也预先使用限制性内切酶 BamHI和EcoRI进行处理。
[0090] (4)对于上述⑵和（3)中得到的亮氨酸拉链基因的片段和MVP基因的片段分别 进行琼脂糖凝胶电泳，切出目标条带，使用Quiagen公司的QIAquickGelExtractionKit， 从凝胶中纯化出目标物。
[0091](5)使用TAKARABIOINC?的DNALigationKit(MightyMix)，使上述（4)中纯 化的两者连接（将连接后的碱基序列示于序列号6,将被表达的亮氨酸拉链、MVP的氨基酸 序列示于序列号7、8)。
[0092] (6)以下，进行与上述的克隆了W-MVP的重组杆状病毒的调制（步骤（1)-(11))、 以及克隆了W-MVP的重组杆状病毒的增殖（步骤（1)-(20))相同的操作，使克隆了LZ-MVP 的重组杆状病毒增殖，制作成病毒液（P4)。
[0093] 〔 3〕向LZ-MVP的亮氨酸拉链与MVP之间插入甘氨酸连接子
[0094] 上述构筑的表达系统中，在亮氨酸拉链基因与MVP基因之间残留有EcoRI的位点 (GAATTC)，有阻碍穹窿体粒子的形成的可能性，所以本发明人将其置换为连接有具有最小 侧链的氨基酸（甘氨酸（Gly)) 3个残基（Gly3)(将氨基酸序列示于序列号9)或6个残基 (Gly6)(将氨基酸序列示于序列号10)的Gly连接子。
[0095] (1)制成以下的3种引物（编码Gly的碱基序列为gcc)。
[0096] ?正向引物（forwardprimer) (lzmvp_0g_f)
[0097]atggcaactgaagaggccat(序列号 11)
[0098] ?正向引物（lzmvp_3g_f)
[0099]ggcggcggcatggcaactgaagaggccatcatccgcatc( #歹12)
[0100] ?反向引物（lzmvp_3g_r)
[0101] GCCAGATTAAAGAAATTAGTTGGCGAACGCggcggcggc(序列号 13)
[0102] 需要说明的是，反向引物（reverseprimer)的互补序列如下。
[0103]gccgccgccgcgttcgccaactaatttctttaatctggc(序列号 14)
[0104] (2)插入Gly3残基的连接子时，插入lzmvp_0g_f和lzmvp_3g_r、Gly6残基的连 接子时，使用lzmvp_3g_f和lzmvp_3g_r作为引物，将先制成的LZ-MVP的pFastBac作为模 板，使用T0Y0B0C0.，LTD?制的KOD-plusMutagenesiskit，进行PCR(94°C、2分钟一98°C、 10秒一68°C、8分钟（将下划线部分设为10循环））。
[0105] (3)PCR之后，使用T0Y0B0CO.，LTD?制的KOD-plusMutagenesiskit所包含的 Dpnl对模板质粒进行消化。在1. 5mL管内将PCR产物50yL和Dpnl2yL进行混合，轻敲、 停转之后，在37°C下孵育1小时。
[0106] (4)在1. 5mL管内将上述（3)的反应液2yL、灭菌水7yL、Ligationhigh5yL和 T4多核苷酸激酶1yL按照这样记载的顺序加入，轻敲、停转之后在16°C下孵育1小时。
[0107] (5)向大肠菌DH5a50yL中加入上述（4)的反应液5yL，在冰上静置30分钟。
[0108](6)42°C下进行45秒热休克。
[0109](7)在冰上静置2分钟。
[0110] (8)加入S0C培养基450yL，在37°C下振荡培养1小时。
[0111] (9)将上述⑶的培养液50yL接种至加入了氨苄西林（100yg/mL)的LB平板。
[0112] (10)37°C下静置培养一晚。
[0113] 之后，进行与上述的克隆了W-MVP的重组杆状病毒的调制步骤（2)-(20)同样的操 作，制成在亮氨酸拉链与MVP之间导入了Gly连接子的LZMVP(LZMVP_Gly3、LZMVP_Gly6)的 病毒液（P4)。
[0114] 〔4〕穹窿体（W-穹窿体、LZ-穹窿体）的纯化
[0115] (1)用3L的旋转烧瓶培养500mL的Sf9细胞，在细胞数成为1X106细胞/mL时， 加入P4或P3的病毒液进行感染，培养3天。
[0116] (2)经过3天培养后，将培养液转移至离心管，通过高速离心分离（4000Xg、30分 钟）使细胞沉淀。
[0117] (3)将沉淀的细胞使用PBSBuffer进行悬浮，将悬浮液转移至离心管，进行高速 离心分离（4000Xg、30分钟），从而清洗细胞，去除培养基成分等。
[0118] (4)将以沉淀的形式而得到的