一种利用牡蛎体腔液中淋巴细胞检测牡蛎倍性的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于海洋农业中贝类多倍体检测技术领域，具体涉及一种利用牡蛎体腔液中淋巴细胞检测牡蛎倍性的方法。
【背景技术】
[0002]动物的循环系统有开管式循环和闭管式循环2种，开管式循环的血液经心脏、大血管流出后，进入器官间或组织间隙，血液与其细胞直接接触。闭管式循环的血液始终在血管中流动，血液与其细胞不直接接触(徐俊延，董秀丽，1998)。对于软体动物而言，其体腔演化为真假体腔并存形式，真体腔退化为痕迹，残留在围心腔以及生殖器官和排泄器官的官腔内，而假体腔广泛存在于器官组织之间的间隙中，其中充满血液，成为血窦，是循环系统的一部分。由于血窦的存在，大多数软体动物循环系统为开管式循环，这种循环与其缓慢的生活方式相适应，但头足类为闭管式循环，即动静脉之间有血管相连，与其敏捷快速运动相适应。大多数软体动物血液是无色的，仅有少量为蓝色，内含血青素(王如才等，2008)。
[0003]牡蛎属于软体动物门瓣鳃纲牡蛎科动物，循环系统为开管式循环，组织间隙间充满了体腔液，体腔液中含有大量的血淋巴细胞。由于牡蛎血淋巴为无色透明液体，为此很难辨认出这种透明液体就是血淋巴。过去牡蛎多倍体的倍性检测过程中，学者们均采用鳃、外套膜、闭壳肌等组织作为实验材料，利用流式细胞仪进行DNA含量测定，从而判断倍性组成。这种取样操作杀死样品本身，不利于该样品以后的应用。因此，开发一种操作简单、无损伤的牡蛎倍性检测方法将具有重要的科研和实际应用价值。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了简化利用流式细胞仪检测DNA含量的步骤，克服当前检测倍性取样时会杀死牡蛎样本的缺陷，而提供一种操作简单、检测准确率达100%，且对检测的牡蛎样品无损伤的利用牡蛎体腔液中淋巴细胞检测牡蛎倍性的方法。
[0005]本发明的利用牡蛎体腔液中淋巴细胞检测牡蛎倍性的方法，其特征在于，其是以牡蛎样品体腔液中淋巴细胞作为检测材料，检测其DNA含量，然后再判定牡蛎样品的倍性组成。
[0006]优选，所述的利用牡蛎体腔液中淋巴细胞检测牡蛎倍性的方法，具体步骤为:
[0007]a、淋巴液抽取:将牡蛎样品放置于海水中，当其自然张开双壳时，利用注射器插入体腔中，取体腔液；
[0008]b、离心重悬:将体腔液离心后去除上清液，加入海水悬浮，过滤，得淋巴细胞；
[0009]C、细胞核染色:将淋巴细胞用DAPI染液染色；
[0010]d、染色后的样品混合均匀后检测其DNA含量，确定牡蛎样品的倍性组成。
[0011]所述的步骤a的牡蛎样品优选壳高为30_以上的牡蛎，个体太小，不容易获得体腔液。
[0012]所述的步骤b的离心，其转速优选为800-1200r/min，转速过大，会导致淋巴细胞破裂，转速过低，淋巴细胞无法沉淀至管底。
[0013]所述的步骤b的过滤优选采用孔径为50-100 μ m滤网过滤。
[0014]所述的步骤c的将淋巴细胞用DAPI染液染色优选是将淋巴细胞放于DAPI染液(4，，6_ 二脒基-2-苯基卩引噪，4’, 6-diamidino-2-pheny I indole,其配制方法是:将 ImgDAPI干粉和25.9g柠檬酸钠溶解于500ml去离子水中)中，染色2?3min。染色后的样品可以直接用于DNA含量检测，也可以放置于-20°C冰箱中长期保存，之后进行DNA含量测定。
[0015]所述的步骤d的染色后的样品混合均匀后检测DNA含量，优选是将染色后的样品混合均匀后直接通过流式细胞仪在波长488nm通道下检测DNA含量，确定牡蛎样品的倍性组成。
[0016]本发明不同于以往牡蛎倍性测定操作，此前的牡蛎DNA含量检测，均需采用鳃、夕卜套膜、闭壳肌等组织作为样品，不仅仅需要制备单细胞悬液，而且还要将样本杀死，导致样品本身的后续工作很难开展。本发明结合牡蛎具有开管式循环，体腔液中含有大量淋巴细胞的特性，仅仅采用体腔液中的单细胞淋巴作为检测样品，不仅仅省略单细胞悬液制备步骤，而且检测准确率为100%，并可以保证牡蛎样品本身100%存活，不受到任何伤害，这为牡蛎倍性活体检测奠定了理论与实践应用基础。本发明具有快速、简便、实用性强等优点。
【具体实施方式】
[0017]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0018]以下实施例中所用DAPI染液，其配制方法为:将Img DAPI干粉和25.9g柠檬酸钠溶解于500ml去离子水混合均匀而成。
[0019]实施例1
[0020]a、淋巴液抽取:于2014年11月，从珠海横琴岛取回壳高为50_80mm的香港牡蝴全三倍体样品100个个体至中国科学院南海海洋研宄所热带海洋生物资源与生态重点实验室，先将其编号，之后放置于温度为25-27°C、盐度为18ppt的海水中，5min后，所有牡蛎微微张开双壳，当其牡蛎自然张开双壳时，利用注射器轻轻插入香港牡蛎体腔中，当牡蛎感觉到针头刺入时，会将两壳紧闭，但不影响体腔液抽取，每只牡蛎抽取1.0ml体腔液，编好号以后放置于离心管中；
[0021]b、离心重悬:将离心管中的体腔液在1000r/min离心，离心后去除上清液，加入0.5ml海水后利用注射器轻轻吹打进行二次悬浮，再用孔径为50 μ m滤网过滤，得到淋巴细胞；
[0022]C、细胞核染色:向淋巴细胞样品中加入0.5ml的DAPI染液，染色处理3min ；
[0023]d、倍性测定:处理后的样品混匀后直接通过流式细胞仪(德国Partec II)在波长488nm通道下检测DNA含量，确定样品倍性组成，结果表明:100个个体中，全部为三倍体，与样品实际情况一致，准确率为100%。之后将抽了体腔液的牡蛎样品放入扇贝笼中，在牡蛎养殖区养成，检测后的三倍体样品均正常生长，90天内100%存活。
[0024]实施例2
[0025]a、淋巴液抽取:于2014年12月，从珠海取回壳高为50_80mm的香港牡蛎二三倍体混合样品50个个体至中国科学院南海海洋研宄所湛江海洋经济动物实验站，先将其编号，之后放置于温度为25-27 °C、盐度为ISppt的海水中，Smin后，所有牡蛎微微张开双壳，当其牡蛎自然张开双壳时，利用注射器轻轻插入香港牡蛎体腔中，当牡蛎感觉到针头刺入时，会将两壳紧闭，但不影响体腔液抽取，每只牡蛎抽取0.SmL体腔液，编好号以后放置于离心管中；
[0026]b、离心重悬:将离心管中的体腔液在800r/min离心，离心后去除上清液，加入0.5ml海水后利用注射器轻轻吹打进行二次悬浮，再用孔径为100 μ m滤网过滤，得淋巴细胞；
[0027]C、细胞核染色:向淋巴细胞样品中加入0.5ml的DAPI染液，染色处理2min ；
[0028]d、倍性测定:处理后的样品混匀后直接通过流式细胞仪(德国Partec II)在波长488nm通道下检测DNA含量，确定样品倍性组成，结果表明:50个个体中，三倍体36个，14个为二倍体，与实际情况一致，检测准确率为100%。将抽了体腔液的二三倍体牡蛎样品分开后，放入扇贝笼中，在牡蛎养殖区养成，发现二三倍体牡蛎样品均正常生长，60天内100%存活。
[0029]实施例3
[0030]a、淋巴液抽取:于2014年12月，从北海取回壳高为30_60mm的香港牡蛎二三倍体混合样品50个个体至中国科学院南海海洋研宄所湛江海洋经济动物实验站，先将其编号，之后放置于温度为25-27°C、盐度为ISppt的海水中，1min后，牡蛎全部微微张开双壳，当其牡蛎自然张开双壳时，利用注射器轻轻插入香港牡蛎体腔中，当牡蛎感觉到针头刺入时，会将两壳紧闭，但不影响体腔液抽取，每只牡蛎抽取0.5mL体腔液，编好号以后放置于离心管中；
[0031]b、离心重悬:将离心管中的体腔液在1200r/min离心，离心后去除上清液，加入0.5ml海水后利用注射器轻轻吹打进行二次悬浮，再用孔径为50 μ m的滤网过滤，得淋巴细胞；
[0032]C、细胞核染色:向淋巴细胞样品中加入0.5ml的DAPI染液，染色处理3min，之后放置于-20°C冰箱中，保存3个月；
[0033]d、倍性测定:将步骤c的保存3个月的样品解冻后，混匀直接通过流式细胞仪(德国Partec II)在波长488nm通道下检测DNA含量，确定样品倍性组成，结果表明:50个个体中，三倍体41个，9个为二倍体，与实际情况一致，检测准确率为100%。将抽了体腔液的二三倍体牡蛎样品分开后，放入扇贝笼中，在牡蛎养殖区养成，发现二三倍体牡蛎样品均正常生长，60天内100%存活。
【主权项】
1.一种利用牡蛎体腔液中淋巴细胞检测牡蛎倍性的方法，其特征在于，其是以牡蛎样品体腔液中淋巴细胞作为检测材料，检测其DNA含量，然后再判定牡蛎样品的倍性组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的利用牡蛎体腔液中淋巴细胞检测牡蛎倍性的方法，具体步骤为: a、淋巴液抽取:将牡蛎样品放置于海水中，当其自然张开双壳时，利用注射器插入体腔中，取体腔液； b、离心重悬:将体腔液离心后去除上清液，加入海水悬浮，过滤，得淋巴细胞； c、细胞核染色:将淋巴细胞用DAPI染液染色； d、染色后的样品混合均匀后检测其DNA含量，确定牡蛎样品的倍性组成。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤a的牡蛎样品是壳高为30_以上的牡蛎。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤b的离心，其转速为800-1200r/min。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤b的过滤是采用孔径为50-100 μ m滤网过滤。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤c的将淋巴细胞用DAPI染液染色是将淋巴细胞放于DAPI染液中，染色2-3min，染色后的样品直接用于DNA含量检测或放置于-20°C冰箱中长期保存，之后进行DNA含量检测。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤d的染色后的样品混合均匀后检测DNA含量是将染色后的样品混合均匀后直接通过流式细胞仪在波长488nm通道下检测DNA含量，确定牡蛎样品的倍性组成。
【专利摘要】本发明公开了一种利用牡蛎体腔液中淋巴细胞检测牡蛎倍性的方法。它是以牡蛎样品体腔液中淋巴细胞作为检测材料，检测其DNA含量，然后再判定牡蛎样品的倍性组成。本发明不同于以往牡蛎倍性测定操作，此前的检测，均需采用鳃、外套膜、闭壳肌等组织作为样品，不仅仅需要制备单细胞悬液，而且还要将样本杀死，导致样品本身的后续工作很难开展。本发明结合牡蛎具有开管式循环，体腔液中含有大量淋巴细胞的特性，仅仅采用体腔液中的单细胞淋巴作为检测样品，不仅仅省略单细胞悬液制备步骤，而且检测准确率为100％，并可以保证牡蛎样品本身100％存活，不受到任何伤害，这为牡蛎倍性活体检测奠定了理论与实践应用基础。本发明具有快速、简便、实用性强等优点。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104818327
【申请号】CN201510194867
【发明人】李军, 张扬, 张跃环, 喻子牛
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年4月22日