常规制备 的局限性。并且，在体外利用mRNA转染DC而产生特异性多靶点CTL细胞的属于第一次。
[0052] 具体地，本发明的方法具有以下优点的至少之一：
[0053]1、国际上首次构建出HCVlmRNA抗原。
[0054] 2、国际上首次利用HCV1抗原mRNA转染DC细胞来体外诱导获得HCV1特异性的靶 向免疫细胞群（富含CTL细胞）。
[0055] 3、本发明的靶向免疫细胞群包含：CTL细胞（⑶8+，⑶3+⑶8+⑶28+)，CIK细胞 (⑶3+⑶56+)，NK细胞（⑶3-⑶56+)，使其不仅具有强大杀伤特定肿瘤细胞的CTL细胞，还有 CIK、NK等免疫细胞，可以提升患者的整体免疫力，明显改善患者的症状，能帮助免疫反应更 加完整、效能更尚。
[0056] 4、靶向免疫细胞群制备的整个过程仅需要12-14天。
[0057] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0058] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中：
[0059] 图1显示了根据本发明一个实施例，HCV1抗原cDNA质粒构建过程中质粒酶切鉴 定的结果；
[0060] 图2显示了根据本发明一个实施例，GFP检测mRNA转染后效果的结果图；
[0061] 图3显示了根据本发明一个实施例，基于靶向性免疫细胞群的流式细胞仪检测结 果获得的统计分析结果。
【具体实施方式】
[0062] 需要说明的是，术语"第一"、"第二"仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相 对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可 以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说 明，"多个"的含义是两个或两个以上。
[0063] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的 实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条 件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等 译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或 仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公 司。
[0064] 实施例1:
[0065] 一、材料与设备
[0066] 1、实验室级别：GLP
[0067] 2、仪器设备：
[0068] 负80度超低温冰箱（中科美菱，DW-HL388);普通冰箱（海尔，双开门，-20°C 和4°C);霉菌培养箱（上海博迅，MJX-160B-Z);恒温水浴箱（SSW-420-2S) ;C02培养箱 (HF240);低速离心机（上海安亭，TDL-40C);倒置生物显微镜（科信，型号：BLD-1);生物 安全柜（苏州净化，双人）；电动移液器（德国普兰德）l-l〇ml;微量移液枪（大龙）1套，4 把；程序降温盒（Thermo);液氮罐（金凤，YDS-120-216) ;PCR仪；凝胶电泳成像系统；电泳 仪；恒温仪；
[0069] 3、细胞培养耗材：
[0070] 细胞培养袋〇^1?^1公司）；75〇112培养瓶、175〇11 2培养瓶、1.81111冻存管、1.51111￡? 管、50ml离心管、15ml离心管，均来自美国Coning公司；0? 22um针头滤器（美国BD公司）； lOOum细胞筛网（美国BD公司）；30ml注射器（上海医疗器械）。
[0071] 4、细胞培养试剂：
[0072] 无血清细胞培养基（Takara，货号：GT-T561);澳大利亚胎牛血清（FBS QUALIFIED AUSTRALIA ORIGIN)，Gibco,货号：10099-141 ;
[0073] 淋巴细胞分离液Ficoll液（GE，货号：17-1440-02);
[0074]青霉素/链霉素双抗溶液（PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL，PS)，Gibco,货号： 15140-122。
[0075] 5、培养基的配制：
[0076]5. 1试剂：
[0077]CTL1因子（包括y干扰素，1000U/ml) :1ml，-20°C长期保存，4°C保存2周；
[0078]CTL2 因子（包括IL-l，1000U/ml;IL-2，1000U/ml;CD3 抗体，100ng/ml;CD28 抗体， lOOng/ml) :1ml，-20°C长期保存，4°C保存 2 周；
[0079]CTL3 因子（包括IL-2，1000U/ml;IL-7,20ng/ml;IL-15,20ng/ml) :1ml，-20°C长 期保存，4°C保存2周；
[0080]CTL4 因子（包括GM-CSF，1000U/ml;IL-4, 500U/ml;TNF-a，500U/ml;IL-1，500U/ ml;IL-6,500U/ml) :1ml，-20°C长期保存，4°C保存 2 周；
[0081] 肿瘤抗原mRNA转染混合物试剂A:100ul，-80°c长期保存，溶解后一次用掉。
[0082] 5. 2配制方法：
[0083] 基础培养基：向无血清细胞培养基中添加2%的庆大霉素，其中将0. 22um针头滤 器过滤后使用。
[0084] CTL1培养基：将1管CTL1因子从-20度取出，常温融化，加到20ml基础培养基中， 并添加10%的客户的血清，其中将0.22um针头滤器过滤后使用。
[0085] CTL2培养基：将1管CTL2因子从-20度取出，常温融化，加到20ml基础培养基中， 其中将0? 22um针头滤器过滤后使用。
[0086] CTL3培养基：将1管CTL3因子从-20度取出，常温融化，加到500ml基础培养基 中，其中将0. 22um针头滤器过滤后使用，整个培养过程用3管。
[0087] DC培养基：将1管CTL4因子从-20度取出，常温融化，加到50ml基础培养基中， 并添加10%的客户的血清，其中将0.22um针头滤器过滤后使用。
[0088]二、方法
[0089] 1构建HCV1抗原cDNA质粒
[0090] 首先，将HCV1抗原基因进行人工合成，并获得基因的cDNA。
[0091] HCV1抗原基因的cDNA序列如下：
[0092] ATTGTTCCTTTTGGCTTTGCTGTCCTGTTTGACCATCCCAGTTTCCGCCTATGAAGTGCGCAACGCGTC CGGGGTGTACCATGTCACGAACGACTGACTCCAACTCAAGCATTGTGTATGAGGCAGACGACATGATCATGCACACC CCCGGATGCGTGCCCTGCGTTCGGGAGGACAACACCTCCCGCTGCTGGGTAGCGCTCACCCCCACACTCGCGGCCAG GAATGCCAGCGTCCCCACCACGACAATACGACGCCACGTCGATTTGCTCGTTGGGGCGGCTGCTCTCTGCTCCGCTA TGTACGTGGGGGATCTCTGCGGATCTGTTTTCCTCGTTTCCCAGCTGTTCACCTTCTCGCCTCGCCGGCATGAGACA GCACAGGACTGCAACTGCTCAATCTATCCCGGCCACGTATCAGGTCACCGCATGGCCTGGGATATGATGATGAACTG GTCACCTTCAACAGCCCTAGTGGTATCGCAGTTACTCCGGATCCCACAAGCCGTCGTGGACATGGTAGCGGGGGCCC ACTGGGGAGTCCTAGCGGGCCTTGCCTACTACTCCTAA(SEQ ID NO：1)
[0093] 然后，以pcDNA3. 1载体为骨架载体，通过酶切方法，将上述人工合成的SEQ ID NO : 1所示的HCV1抗原基因cDNA序列克隆至载体上，制备获得HCV1抗原cDNA质粒。
[0094] 其中，质粒酶切图片见图1。如图1所示，左侧泳道为：DNA marker，由上至下，条 带顺序：250bp，500bp，750bp，lOOObp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp，lOOOObp;右侧泳道 为：A040-1质粒，是通过对pcDNA3. 1载体的BamHI/Sall酶切位点进行酶切消化获得的。