[0095] 经过测序及酶切鉴定，人工合成的HCV1基因序列正确，发明人成功构建获得了 HCV1抗原cDNA质粒。
[0096] 2体外转录
[0097] 2. 1线性化处理
[0098] 取构建好的HCV1抗原cDNA质粒，基于pcDNA3. 1载体建议的线性化酶切位点 Bstll07I (距离终止密码子比较远，2KB左右）进行线性化处理。
[0099] 2. 2体外转录
[0100] 利用I7Message Machine试剂盒（Ambion公司），将经过线性化处理的HCV1抗原 cDNA质粒（即作为体外转录的DNA模板）进行体外转录，具体如下：
[0101] 首先，在一个RNase-free的塑料离心管中，在室温下按次序加入下列成分，制备 反应体系（20微升）：
[0102]
【主权项】
1. 一种制备DC细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤： 将单核细胞进行第一诱导分化培养，以便获得未成熟的DC细胞； 利用HCVl抗原mRNA转染所述未成熟的DC细胞，以便获得经过转染的未成熟DC细胞； 以及 将所述经过转染的未成熟DC细胞进行第二诱导分化培养，以便获得成熟的DC细胞， 其中，所述单核细胞是从样本的外周血单个核细胞中分离获得的。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HCVl抗原mRNA是通过以下步骤获得 的： 制备HCVl抗原cDNA质粒，所述HCVl抗原cDNA的核酸序列如SEQ ID NO :1所示； 将所述HCVl抗原cDNA质粒进行线性化处理，以便获得经过线性化处理的HCVl抗原 cDNA质粒；以及 将所述经过线性化处理的HCVl抗原cDNA质粒进行体外转录，以便获得HCVl抗原 mRNA 〇
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以pcDNA3. 1载体为骨架载体，制备所述 HCVl抗原cDNA质粒， 任选地，所述pcDNA3. 1载体具有BamhI、XbaI和Bstl 107 I酶切位点， 任选地，基于酶切位点Bstll07 I进行所述线性化处理， 任选地，利用T7 Message Machine试剂盒进行所述体外转录， 任选地，在进行所述体外转录后，进一步包括除杂纯化的步骤。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用电转或PEI法进行所述转染， 任选地，利用PEI法进行所述转染，其中，PEI与所述HCVl抗原mRNA的混合质量比为 3:1， 任选地，利用DC培养基进行所述第一诱导分化培养和所述第二诱导分化培养， 任选地，所述DC培养基包含： 无血清细胞培养基； 100~1000U/ml的CTL4因子；以及 2体积％~10体积％的自体血清， 其中，所述血清来源于所述样本， 任选地，所述无血清培养基为Takara的无血清培养基， 任选地，所述无血清培养基中添加有0. 5体积％~5体积％的抗生素，优选庆大霉素， 任选地，进行所述第一诱导分化培养4-5天，每2-3天半换液一次， 任选地，进行所述第二诱导分化培养4-5天，每2-3天半换液一次。
5. -种制备靶向性免疫细胞群的方法，其特征在于，包括以下步骤： 提供样本的外周血单个核细胞； 将所述样本的外周血单个核细胞分离为淋巴细胞和单核细胞； 将所述淋巴细胞进行活化培养，以便获得经过活化培养的淋巴细胞； 将单核细胞进行第一诱导分化培养，以便获得未成熟的DC细胞； 利用HCVl抗原mRNA转染所述未成熟的DC细胞，以便获得经过转染的未成熟DC细胞； 将所述经过转染的未成熟DC细胞进行第二诱导分化培养，以便获得成熟的DC细胞；以 及 将所述成熟的DC细胞与所述经过活化培养的淋巴细胞进行混合培养，以便获得靶向 性免疫细胞群。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述HCVl抗原mRNA是通过以下步骤获得 的： 制备HCVl抗原cDNA质粒，所述HCVl抗原cDNA的核酸序列如SEQ ID NO :1所示； 将所述HCVl抗原cDNA质粒进行线性化处理，以便获得经过线性化处理的HCVl抗原 cDNA质粒；以及 将所述经过线性化处理的HCVl抗原cDNA质粒进行体外转录，以便获得HCVl抗原 mRNA, 任选地，以pcDNA3. 1载体为骨架载体，制备所述HCVl抗原cDNA质粒， 任选地，所述pcDNA3. 1载体具有BamhI、XbaI和Bstl 107 I酶切位点， 任选地，基于酶切位点Bstll07 I进行所述线性化处理， 任选地，利用T7 Message Machine试剂盒进行所述体外转录， 任选地，在进行所述体外转录后，进一步包括除杂纯化的步骤。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用电转或PEI法进行所述转染， 任选地，利用PEI法进行所述转染，其中，PEI与所述HCVl抗原mRNA的混合质量比为 3:1， 任选地，所述活化培养包括： 利用CTLl细胞培养基对所述淋巴细胞进行第一活化培养24小时； 利用CTL2细胞培养基对经过第一活化培养的淋巴细胞进行第二活化培养2-3天；以及 利用CTL3细胞培养基对经过第二活化培养的淋巴细胞进行第三活化培养4-5天，每隔 2-3天等量补液一次， 任选地，所述CTLl细胞培养基包含： 无血清细胞培养基； 100~1000U/ml的CTLl因子；以及 2体积％~10体积％的自体血清， 所述CTL2细胞培养基包含： 无血清细胞培养基； 100~1000U/ml的CTL2因子；以及 2体积％~10体积％的自体血清， 所述CTL3细胞培养基包含： 无血清细胞培养基； 100~1000U/ml的CTL3因子；以及 2体积％~10体积％的自体血清， 其中，所述血清来源于所述样本， 任选地，所述无血清培养基为Takara的无血清培养基， 任选地，所述无血清培养基中添加有0. 5体积％~5体积％的抗生素，优选庆大霉素。
8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用DC培养基进行所述第一诱导分化培 养和所述第二诱导分化培养， 任选地，所述DC培养基包含： 无血清细胞培养基； 100~1000U/ml的CTL4因子；以及 2体积％~10体积％的自体血清，其中，所述血清来源于所述样本， 任选地，所述无血清培养基为Takara的无血清培养基， 任选地，所述无血清培养基中添加有0. 5体积％~5体积％的抗生素，优选庆大霉素， 任选地，进行所述第一诱导分化培养4-5天，每2-3天半换液一次， 任选地，进行所述第二诱导分化培养4-5天，每2-3天半换液一次， 任选地，利用CTL3细胞培养基进行所述混合培养6-8天，优选7天， 任选地，所述CTL3细胞培养基包含： 无血清细胞培养基； 100~1000U/ml的CTL3因子；以及 2体积％~10体积％的自体血清， 其中，所述血清来源于所述样本， 任选地，所述无血清培养基为Takara的无血清培养基， 任选地，所述无血清培养基中添加有0. 5体积％~5体积％的抗生素，优选庆大霉素， 任选地，按照所述成熟的DC细胞与所述经过活化培养的淋巴细胞的体积比为1 :20进 行所述混合培养。
9. 一种靶向性免疫细胞群，其是通过权利要求5-8任一项所述的方法制备获得的。
10. 权利要求9所述的靶向性免疫细胞群，以及利用权利要求1-4任一项所述的制备 DC细胞的方法制备获得的DC细胞在制备药物中的用途，所述药物用于抑制肿瘤转移、扩 散、复发， 任选地，所述肿瘤为HCVl抗原阳性肿瘤，优选肝癌。
【专利摘要】本发明公开了DC细胞、靶向性免疫细胞群及其制备方法和用途，其中制备DC细胞的方法包括：将单核细胞进行第一诱导分化培养，以便获得未成熟的DC细胞；利用HCV1抗原mRNA转染所述未成熟的DC细胞，以便获得经过转染的未成熟DC细胞；以及将所述经过转染的未成熟DC细胞进行第二诱导分化培养，以便获得成熟的DC细胞，其中，所述单核细胞是从样本的外周血单个核细胞中分离获得的。利用该发明能够安全高效地制备DC细胞，且本发明的方法成本低、效率高、且能够有效地解决细胞毒性问题，能够有效用于免疫细胞治疗或用于刺激同样患者来源的淋巴细胞产生富含大量CTL细胞的靶向性免疫细胞群，进而用于肿瘤免疫治疗后效果更好。
【IPC分类】C12N15-87, A61P35-00, A61K39-00, C12N5-10, A61K35-17, C12N5-0783
【公开号】CN104830789
【申请号】CN201510225521
【发明人】杨光华, 李财新
【申请人】杨光华
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月5日