Lrk2基因在提高水稻抵御干旱能力中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种LRK2基因在提高水稻抵御干旱能力中 的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻作为世界上三大粮食作物之一，近一半的世界人口以大米为主食。我国也有 近65 %的人口以稻米为主食。然而世界范围内的降水减少和分布不均对水稻的生产影响很 大。农业用水占全国用水总量的68%，而水稻用水量又占农业用水量的六成（农业部2008 年公开数据）。然而，主要由于年际间雨型变化和水稻生长季节降雨量的分布不均，干旱胁 迫仍然是制约水稻生产的最重要的单个影响因子，在远离河流的偏远山区情况更是如此。 2030年我国人口将达到16亿，为满足粮食需求，农业用水将有巨大缺口，水资源紧缺将成 为21世纪我国粮食安全的瓶颈，我国水资源条件根本无法支撑传统水稻的进一步发展。因 此，增强水稻耐旱性以减少供水量，是减少水稻生产中水资源消耗的迫切需求，对我国具有 特别重要的意义。
[0003] 然而，水稻耐旱性是一个综合性状，包含发育、生理、生化和分子等多个方面的适 应性变化，比如根的生长发育的变化、保卫细胞的调控、渗透适应、光合作用的改变、保护性 蛋白和抗氧化蛋白的合成等。这些调控途径的复杂性导致人们对它们的了解很少，它们仍 然是目前研宄的焦点。水稻耐旱性与环境存在较大的互作，再加上人们对耐旱机制了解有 限，使水稻耐旱育种进展缓慢。不过，还是有许多基因被证实在耐旱中发挥了重要作用，并 且实验室测定显示，其中一些基因的遗传转化可以改良水稻抗旱性，如：在拟南芥和水稻中 超表达DREB1A，可提高植物对干旱、高盐和低温的耐性。本项目的研宄成果不仅能加深对水 稻抗旱调控机理的理解，而且对作物分子育种具有重要的理论与实践指导意义。
[0004] 植物富亮氨酸类受体蛋白激酶（leucine-rich-repeat receptor kinases, LRKs) 在真核生物中广泛存在，拟南芥和水稻中分别鉴定出这个基因亚家族的216和300多个成 员。LRK在植物生长发育和抗性反应中起着广泛的调节作用，目前克隆的一些类受体激酶 基因主要来源于拟南芥，它们分别在分生组织形成、油菜素内酯信号转导、维管束分化、器 官大小和形态控制、细胞增殖、体细胞胚胎发生、以及植物创伤反应等生物过程中起重要作 用。富亮氨酸类受体蛋白激酶由信号肽、胞外富亮氨酸受体结构域、跨膜区和胞内激酶域4 部分组成，这些激酶位于细胞膜上，感受干旱、低温、高盐以及生长发育等产生的信号，并激 活下游信号传递体，引发一系列信号转导过程。例如Hong等从拟南芥植株分离到一种类似 受体的蛋白激酶基因 RPKI，其在植物的根、茎、叶和花中都能够表达，并且在干旱或高盐胁 迫下均能增强表达。在水稻中已经鉴定的LRK基因为数不多，主要有：Xa21，Xa26, OsSERKI 等，水稻中大多数类受体激酶功能尚未验证。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供LRK2基因或含有LRK2基因的重组载体的新用 途。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供具体通过以下技术方案实现：
[0007] 本发明提供了 LRK2基因或含有LRK2基因的重组载体在提高水稻抗旱能力的应 用。
[0008] 所述的LRK2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 所述的LRK2基因的表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0010] 所述的含有LRK2基因的重组载体为将所述的LRK2基因插入表达载体中，得到的 表达载体。
[0011] 在本发明中，所述的应用为将所述的LRK2基因导入目的植物中，得到抗旱能力大 于所述目的植物的转基因植物。所述的LRK2基因通过所述的含有LRK2基因的重组载体导 入目的植物中。
[0012] 分子克隆试剂：Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System(Promega 生物有限公司）、爱思进PCR纯化试剂盒（爱思进生物技术有限公司）、上海生工胶回收试 剂盒（上海生工有限公司）、高效感受态细胞制备试剂盒（上海GeneRay生物有限公司）、 PrimeSTAR? HS DNA Polymerase (宝生物工程（大连）有限公司）、2 X Taq Master Mix (南 京博尔迪生物科技有限公司）、Taq DNA Polymerase (TIANGEN生物（北京）有限公司）、 Trans2K Plus DNA Marker (全式金生物技术有限公司）、各种限制性内切酶（宝生物工程 (大连）有限公司以及Promega有限公司）、T4DNA Ligase (Promega有限公司）。总RNA 提取试剂盒 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN);逆转录试剂盒 superscript III Reverse Transcriptase, RNase-Free DNase set (QIAGEN);质粒提取试剂盒（promega)高保真酶 primestar Taq(Takara);限制性内切酶（Takara/promega)引物合成及DNA序列测定：由英 潍捷基（上海）贸易有限公司和上海杰李生物有限公司完成。
[0013] 1、在本发明中：水稻 DNA 提取，可依据51^116七&1.(1996).51^11，^.，￥11，1'· S. , Tong, ff. F. and Yu, S. Μ. (1996)Carbohydrate starvation stimulates differential expression of rice alpha-amylase genes that is modulated through complicated transcriptional and posttranscriptionalprocesses. J.Biol.Chem.271,26998 -27004。
[0014] 例如为以下：
[0015] (I)取新鲜的水稻叶子放于I. 5ml离心管中，加入200 μ I裂解液。
[0016] (2)用研磨棒将叶子尽量磨成匀浆，利于裂解。
[0017] (3)将离心管放入65°C烘箱中温育30min，每IOmin充分混匀一次。
[0018] (4)将离心管从烘箱取出，加入65 μ I 5M的KAC溶液，上下颠倒温和混勾，然后放 置于-20°C冰浴5min。
[0019] (5)加入300 μ 1氯仿，剧烈振荡混勾，12000rpm，离心10min。
[0020] (6)取上清液约300 μ 1，加至新的无菌I. 5ml离心管中，再加入180 μ 1异丙醇，上 下颠倒温和混匀，室温下放置l〇min，12000rmp，离心5min，可见管底部的小块沉淀物（含 DNA)，弃上清。
[0021] (7)加入800 μ 1 70%乙醇，充分混勾，室温下放置IOmin。
[0022] (8) 12000rmp，离心5min，弃上清，并用枪头吸去残留的乙醇，将离心管放在干燥 处，待管内完全干燥后加入150-200 μ 1的PCR H2O，溶解DNA，保存于-20°C。
[0023] 2、引物设计
[0024] 检索NCBI数据库查找水稻日本晴基因组，得水稻LRK2基因序列，根据载体 PCAMBIA1300S的酶切位点设