猪α干扰素基因及其合成方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及一种基因及其合成方法，具体涉及一种猪α干扰素基因及其合成方法。
【背景技术】
[0002]干扰素主要是由动物细胞在病毒等诱生剂的作用下诱导产生的。许多动物，包括人、哺乳动物、鸟类、鱼类等都能产生干扰素。根据干扰素的抗原特性和分子结构分成不同的类型。干扰素(IFN)分为I型和II型，I型干扰素基因缺少内含子，包括α、β、δ、ω、τ 5种类型，II型仅有γ型I种，含有内含子。它们具有相关的结构并共用同一受体(第一受体)，第一受体分布相当广泛，包括单核/巨噬细胞、多形核白细胞、B细胞、T细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞与肿瘤细胞等。I型干扰素的表达常因细胞类型和诱导物的不同而异。IFN-α主要由单核吞噬细胞产生，B细胞和成纤维细胞也能合成IFN-α。IFN-β则主要由成纤维细胞产生。而造血细胞则产生IFN-ω。在牛、绵羊胚胎着床的早期，其子宫内膜上皮细胞中能产生大量IFN- τ，它与维持正常妊娠有关。IFN-α、β、δ主要是对病毒感染的应答产生的，能诱导机体抗病毒蛋门的产生。II型干扰素又称免疫干扰素，即IFN-γ，主要由活化的T淋巴细胞(包括ΤΗ0、THl细胞和几乎所有的⑶8+Τ细胞)和NK细胞产生。由于干扰素具广谱、高效抗病毒功能，及其对免疫系统起关键调节作用，因此成为当今免疫学、遗传学和分子生物学研宄最为活跃的领域之一。
[0003]目前，已经完成了猪α干扰素基因的测序，基于基因工程技术的一系列异源表达猪α干扰素蛋白的工作已经展开。干扰素作为新一代的兽药以其抗病毒作用广泛、残留小、廉价、无污染、无耐药性、无药物残留等优点很快引起了人们的重视。由诱生剂诱导产生的天然猪IFN-α，因来源少、成本高、纯化工艺复杂等诸多原因而价格昂贵，极大的限制了临床和科研的应用，而利用基因工程技术选择一个合适的系统，使其得到高效表达，生产具有廉价、广谱抗病毒活性、无毒害、无残留等优点的干扰素已经无疑是促使干扰素在兽医临床上推广应用的有效途径。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题，是提供一种猪α干扰素基因及其合成方法，所提供的基因能够实现干扰素在毕赤酵母的高表达，获得具有抗病毒活性的猪α干扰素蛋白；其合成方法不需甲醇诱导，只需采用含葡萄糖的培养基即可表达干扰素，所制备出的猪α干扰素基因抗VSV活性为3.82X 107U/mg。
[0005]为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是:
一种猪α干扰素基因，其DNA序列如下所示:
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[0006]本发明还提供了上述猪α干扰素基因的合成方法，它按照以下步骤顺序进行:
(1)登录GeneBank，查找编码猪α干扰素成熟蛋白的基因序列；
(2)将猪α干扰素的编码密码子与毕赤酵母Χ-33偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性，将猪α干扰素密码子替换为毕赤酵母Χ-33偏好的密码子；
(3)将替换后的序Y,3r端分别加上EcoR1、XbaI酶切位点，进行全基因合成，并连入真核表达质粒pGAPZ a A中，得到重组真核表达质粒pGAPZ a A-1FN- α。
[0007]由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于: 本发明所提供的猪α干扰素基因能够实现干扰素在毕赤酵母的高表达，获得具有抗病毒活性的猪α干扰素蛋白；其合成方法不需甲醇诱导，只需采用含葡萄糖的培养基即可表达干扰素，所制备出的猪α干扰素基因抗VSV活性为3.82X 107U/mg。本发明的合成方法采用在不改变猪α干扰素氨基酸序列的基础上设计其编码核酸序列，使阅读框内的每个密码子都采用毕赤酵母偏爱的密码子；在人工合成步骤中设计的编码核酸。后将合成的核酸插入适当的表达载体，构建重组表达载体；最后将构建的重组表达载体转化适当的毕赤酵母进行诱导表达，结果显示猪α干扰素在毕赤酵母的高表达，获得具有抗病毒活性的猪α干扰素蛋白。
[0008]本发明适用于猪α干扰素的合成。
[0009]本发明下面将结合说明书附图与具体实施例作进一步详细说明。
【附图说明】
[0010]图1为本发明实施例1的猪干扰素工程菌的PCR电泳图；
图2为本发明实施例1的猪干扰素工程菌发酵不同时间的SDS-PAGE图；
图3为本发明实施例1的猪干扰素纯化效果SDS-PAGE电泳图。
【具体实施方式】
[0011]实施例1 一种猪α干扰素基因及其合成方法一种猪α干扰素基因，其DNA序列如下所示:
tgtgacctacctcaaacgcattctctagctcatacaagagcactaagactgctggcacaaatgagaagaatctcccctttctcttgtctggatcatagaagagacttcggaagtccacacgaagcttttggaggtaaccaagttcaaaaggctcaagctatggcattggtacatgaaatgctgcagcaaactttccaacttttctccaccgaaggttcagctgctgcatgggatgaatctcttttgcaccaattttgtaccggtttggatcagcagttgagagacttggaagcttgcgttatgcaggaagctggcttagaagggactccattgttagaagaggattctatattggccgttcgaaaatactttcacaggttaactttgtatcttcaggagaagagttatagtccctgcgcctgggagattgtccgtgccgaggtgatgaggtccttttcttcatcacgtaatcttcaggatcgtttacgaaagaaagagtaa。
[0012]具体合成方法按照以下步骤顺序进行:
(一)猪α干扰素基因的合成登录GeneBank，查找编码猪α干扰素成熟蛋白的基因序列(序列号为ACV42395.1)，利用SignalP 3.0Server软件预测此基因可能含有一段信号肽序列，为其氨基酸序列的前23个氨基酸，利用TargetP 1.1Server软件检测此序列功能，发现其为帮助蛋白分泌的信号肽而非蛋白结构所必需，后续研宄是在毕赤酵母中进行表达，采用的载体中有更适合外源基因在酵母中分泌的信号肽，所以我们去掉信号肽序列，剩下编码成熟猪α干扰素的基因序列，其核苷酸长度为501b