一种细菌内毒素核酸适体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种核酸，特别涉及细菌内毒素的核酸适体及其在去除细菌内毒素中 的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 1892~1895年，Richard Pfeiffer发现，热灭活的霍乱弧菌溶解物中，含有一种 毒性成分，能引起实验动物休克和死亡。为了与霍乱弧菌所分泌的不耐热外毒素相区分，他 将该热稳定的物质称为内毒素。
[0003] 内毒素主要成分是脂多糖（LPS)，其化学结构主要分为两部分：多糖和类脂 A(Lipid A)，其中类脂A是内毒素的活性中心。在已经知道的各种热源性物质中，内毒素是 普遍存在也是最重要的一种。它是革兰氏阴性杆菌生长时释放或死亡时由细胞壁裂解产生 的一类脂多糖类物质，极微量（纳克级）内毒素进入人体就会引起高热，腹泄，血管扩张， 浑身不适，甚至昏厥或死亡。常规的内毒素去除方法有：活性炭吸附、萃取、超滤、多粘菌素 B等。常规方法由于特异性不强，或者其本身存在毒性，不利于内毒素安全、特异性的去除。 因此设计一种高亲和力和高选择性的结合细菌内毒素配基将会对内毒素的控制和去除有 重要意义。
[0004] 核酸适体是指从人工合成的单链DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲和性和高 特异性地与靶分子结合的单链寡核苷酸。核酸适体借助氢键、范德华力、疏水作用等分子 间作用力形成特殊的三维结构，如发夹、假结、凸环、G -四聚体等，从而特异地识别靶物质 并影响其生物活性。核酸适体本身特有的生化特性使其在生物医药应用领域具有诸多优 势，如靶分子范围广、亲和力与特异性强、合成修饰方便快速、良好的生物相容性、其组成为 无毒的核苷酸、体外稳定性好等。核酸适体可以通过配体指数富集进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)筛选获得，其基本原理是在 体外人工化学合成一个寡核苷酸文库，包括RNA、ssDNA或修饰的RNA和ssDNA，通过寡核苷 酸文库与目标分子的相互作用，结合PCR技术指数级放大与靶分子特异结合的寡核苷酸， 经过几轮或数十轮筛选过程，获得高亲和力和高特异性的核酸适体。
[0005] 由于常规内毒素去除方法特异性不强，或者其本身存在毒性，不利于内毒素安全、 特异性的去除，而核酸适体由于其本身特有的生化特性有利于内毒素高效，特异性的去除。 将带上生物素的核酸适体与带有链霉亲和素的磁珠结合后即得核酸适体一磁珠，该带有核 酸适体的磁珠可用于样品中内毒素的去除，且将磁珠放于磁力架上就可将内毒素与溶液分 离，该去除内毒素的方法简单、快速、特异性好。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种具有高特异性和高亲和力的细菌内毒素的核酸适体，以及 该核酸适体在去除细菌内毒素中的应用，将核酸适体与带有链霉亲和素的磁珠结合后即得 核酸适体一磁珠，该带有核酸适体的磁珠可用于样品中内毒素的去除，且将磁珠放于磁力 架上就可将内毒素与溶液分离，该去除内毒素的方法简单、快速、特异性好。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明提供一种细菌内毒素核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1 (记为 EAQl)、SEQ ID NO. 2 (记为 EAQ2)或 SEQ ID NO. 3 所示（记为 EAQ3)，优选 SEQ ID NO. 3 所示。
[0009] SEQ ID NO. 1 ：
[0010] ATGAGAGCGTCGGTGTGGTACCACGCGCGGACAACAAGACAGCGTGCCTGCAGTGTGTAGGAGGGTGCG GAAGTA ；
[0011] SEQ ID NO. 2 ：
[0012] ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATCGCCGCGCTCGCCGATCGTTCCTCCCCCCCCGTGTGTAGGAGGGTGCG GAAGTA ；
[0013] SEQ ID NO. 3 ：
[0014] ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAGCCATGCGCCGACCCAGGTCTAAGAGCCTCGGCCGTGTAGGAGGGTGCG GAAGTAo
[0015] 本发明所述细菌内毒素核酸适体的制备方法包括以下步骤：
[0016] (1)合成两端为固定序列、中间为35个碱基的随机序列（通常库容量为IOltl条以 上）的单链DNA随机寡核苷酸库，将合成的单链DNA随机寡核苷酸库溶于结合缓冲液1形 成0. 05~0. 15 μ M核酸溶液，将核酸溶液在90°C加热5min，在冰上放置15min，然后室温 放置5min，获得预处理后的单链DNA随机寡核苷酸库；所述结合缓冲液1组成为20mmol/ LHePes，5mmol/L KCl，120mmol/L NaCl，lmmol/L MgCl2, I mmol/L CaCl2, pH7. 3 ；
[0017] 所述单链DNA随机寡核苷酸库的序列为：
[0018] 5' -ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-35nt-TGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3'，nt 表示 35 个碱基 的随机序列；所述洗脱缓冲液组成为20mMTris-HCL，4M异硫氰酸胍，ImM DTT，pH8. 3 ;
[0019] (2)以键合多粘菌素 B的琼脂糖凝胶颗粒为基质，加入内毒素孵育后（37°C，130r/ min，振荡lh)，再加入预处理后的单链DNA随机寡核苷酸库孵育（37°C，130r/min，振荡lh)， 除去上清液（即除去未与内毒素结合的单链DNA)，而与内毒素结合的单链DNA则留在琼脂 糖凝胶上，将琼脂糖凝胶上的单链DNA用洗脱缓冲液洗脱、收集流出液，即得与细菌内毒素 特异性结合的核酸序列（单链DNA);所述洗脱缓冲液组成为20mM Tris-HCL，4M异硫氰酸 胍，ImM DTT，ρΗ8· 3 ;
[0020] (3)将步骤⑵所得与细菌内毒素特异结合的核酸序列在引物1和引物2的作用 下进行对称PCR扩增反应，再将对称PCR扩增产物在引物2和引物3的作用下进行不对称 PCR反应，获得的单链DNA经切胶，纯化，即得用于此轮筛选的单链DNA文库，形成次一级核 酸库；
[0021] 引物 1 :5'-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-3' ；
[0022] 引物 2 :5'-TACTTCCGCACCCTCCTACA-3' ；
[0023] 引物 3 :5'-biotin-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-3' ；
[0024] (4)将步骤（3)所得的单链DNA文库，按步骤⑵和步骤（3)进行下一轮筛选，经 过10~20轮筛选后获得目的寡核苷酸序列，即为细菌内毒素核酸适体；将所述目的寡核苷 酸序列通过PMD-18T载体转入大肠杆菌克隆，测序所述目的寡核苷酸序列；
[0025] (5)人工合成步骤（3)中测序得到的单链DNA，并通过PMB - Elisa法鉴定其与靶 蛋白结合的亲和力和特异性，筛选对细菌内毒素特异性好、亲和力高的序列，筛选细菌内毒 素核酸适体。
[0026] 本发明还提供一种所述细菌内毒素核酸适体在去除内毒素中的应用，所述应用是 将细菌内毒素核酸适体与磁珠结合，然后再与待测样本中的内毒素特异性结合，从而去除 待测样本中的内毒素，具体为：将细菌内毒素核酸适体与带链霉亲和素的磁珠在缓冲液中 于20~40°C静置25~70min，得到核酸适体-磁珠，再将此核酸适体-磁珠与待测样品在 缓冲液中于20~40 °C孵育25~35min，取上清液，获得去除内毒素的样本。
[0027] 更具体，本发明所述细菌内毒素核酸适体在去除内毒素中的应用为：将链霉亲和 素磁珠加入离心管中，将离心管放置在磁铁上1~2min，吸去上清；取下离心管用结合缓 冲液2洗涤；将细菌内毒素核酸适体与结合缓冲液2的混合液加入离心管中，室温静置 30min ;将离心管放于磁铁上1~2min，吸去上清，用结合缓冲液1洗涤；向离心管中加入 待测样本的结合缓冲液1溶液，37°C孵育30min ;将离心管放于磁铁上1~2min，吸取上 清，即可得到去除内毒素的样本溶液；所述结合缓冲液2为含lmMEDTA+2M NaCl的10mM、pH 7. 5Tris_HCl，结合缓冲液 1 为含 5mmol/LKCl+120mmol/L NaCI +Immol /T, MgCl2+l mmol/L CaCl2的 ρΗ7· 3、20mmol/LHePes。
[0028] 本发明筛选获得的核酸适体用于内毒素的去除，包括以下步骤：将核酸适体用带 生物素的引物（即引物3)进行不对称PCR，得到带生物素的核酸适体，将带生物素的核酸适 体与带链霉亲和素的磁珠在缓冲液中于20~40 °C静置孵育25~70min，得到核酸适体-磁 珠，将此核酸适体-磁珠与含有内毒素的样品在缓冲液中于20~40°C孵育25~35min，取 上清液，用鲎试剂检测内毒素含量，即可得到核酸适体吸附的内毒素量。改变吸附时间和细 菌内毒素的浓度，分别测定静态吸附曲线和等温吸附曲线，用于验证该去除方法的可行性。 根据可行性结果，将该去除内毒素的方法用于去除实际样品中的内毒素。
[0029] 本发明所述细菌内毒素核酸适体的应用中的磁珠型号为 DynabeadsM_280Streptavidin，购于 Invitrogen 公司，Dynabeads M_280Streptavidin 是 英潍捷基公司生产的，直径为2. 8 μπι的共价连接有链霉亲和素的磁珠。
[0030] 由于所述核酸适体具有结合细菌内毒素的活性特征，因此所述细菌内毒素核酸适 体可作为去除细菌内毒素的配基，优选核酸适体EAQ3。
[0031] 本发明的优点在于：首先，通过多粘菌素 Β，把细菌内毒素固定到琼脂糖凝胶颗粒 上，避免了传统方法中通过共价反应偶联到基质上对靶标构象的影响。其次，PMB-Elisa法 使得检测简便且灵敏度高。而且筛选获得的核酸适体本身无毒性，分子量小，渗透性好，易 于合成与标记。通过SELEX方法筛选获得的核酸适体只特异性识别细菌内毒素，对其它多 糖不具有识别功能。上述优点使得所述核酸适体成为结合细菌内毒素特异性配基，可选择 性去除样品中细菌内毒素。 (四）【附图说明】
[0032] 图1为该实验的实验流程图。
[0033] 图2为核酸适体EAQ3吸附动力曲线。
[0034] 图3为核酸适体EAQ3吸附等温线。 (五）【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0036] 实施例1体外筛选与细菌内毒素特异结合的核酸适体
[0037] 体外筛选与细菌内毒素特异结合的核酸适体按以下步骤进行：
[0038] 1、体外合成单链DNA随机寡核苷酸库，单链