p;将猪α干扰素的编码密码子与毕赤酵母偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性，在不改变氨基酸组成和排列顺序的基础上，对已知的编码猪α干扰素的基因序列进行改造，替换为毕赤酵母喜好的密码子，旨在提高基因在毕赤酵母的表达水平；
然后将替换后的序列5'、3;端分别加上EcoR1、XbaI酶切位点，送上海生工生物公司进行全基因合成，并连入真核表达质粒PGAPZaA中，得到重组真核表达质粒pGAPZa A-1FN-α 。
[0013](二)猪α干扰素的真核表达
(1)重组质粒pGAPZa A-1FN-α采用BspHI酶切酶线性化；
(2)将测序正确的重组质粒pGAPZαΑ-1FN-α线性化后转入毕赤酵母Χ_33，挑取单菌落进行PCR鉴定，PCR采用引物F1/F2，
以 5’ -GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’ 为上游引物；
以 5’ -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’ 为下游引物；
PCR总体积为25 yL，其中2.5 yL buffer，IyL dNTP，上游引物0.5 μ L，下游引物0.5yL，毕赤酵母Χ-33 I μ L，Taq 0.1 μ L，ddH20 19.4 μ L ;其中，上下游引物的浓度均为10 ymol/L ；dNTP 的浓度为 10 mmol/L。
[0014]反应条件为以95°C 5min，95°C lmin，55°C lmin，72°C 80s 为一个循环，经过 30个循环，最后72°C延伸lOmin，得到大小约900bp的目标条带；
(3)挑取YPD平板上X33菌株分别接种进入20ml液体YPD培养基，30°C，250r/m培养至(?=1.3、1.4或1.5;再按I %的比例将菌液接种于液体YPD培养基中，30°C，250r/m培养36h后取样1ml，之后每隔12h取样，把上述样品进行SDS-PAGE电泳，以确定最佳表达时间；其中，YPD培养基包括1%酵母膏、2%蛋白胨和2%葡萄糖。
[0015]试验结果表明:挑取的6株菌PCR检测显不为阳性，大小(约900bp)和理论值一致，如图1所示(其中M表示DNA标准Mark ; A表示阳性对照，为pGAPZ a A-1FN-α质粒；1_6表示编号1-6的菌株PCR结果)，该工程菌采用pGAPZ a A质粒，不需甲醇诱导，只需采用含葡萄糖的培养基即可表达干扰素，其不同发酵时间的表达量如图2所示(其中M为蛋白质标准Mark ；1为发酵24h的上清液；2为发酵36h的上清液；3为发酵48h的上清液；4为发酵60h的上清液；5为发酵72h的上清液。)，在60h表达量最高，所以最佳的发酵时间为60h。
[0016]将所合成出的重组猪α干扰素进行提取，提取过程如下所示:
(I)在4°C，8000rpm离心15min收集上清用于猪干扰素的纯化。
[0017](2)通过微滤超滤获得浓缩样品，将样品分别上DEAE Sepharose弱阴离子交换柱和Phenyl疏水柱(XK 16/20)，纯化的干扰素样品进行SDS-PAGE电泳检验纯化结果，用Broadford法测定蛋白浓度。
[0018]实验结果:纯化得到的猪干扰素SDS-PAGE如图3所示(其中，M表示蛋白质标准Mark ;1表示纯化后的猪干扰素)，纯度合格。
[0019]将上述重组猪α干扰素抗病毒进行活性测定，采用微量细胞病变抑制法进行测定，将ΡΚ-15接种96孔板，待长成单层后弃去生长液，加入10倍倍比稀释的重组猪α干扰素，每个稀释度做8个重复，培养24小时后弃上清，用10TCID50的水疱性口炎病毒(VSV)进行攻毒，同时设立阴性对照(只加10倍稀释的干扰素，不加病毒)，阳性对照(只加病毒，不加干扰素)，空白对照(不加干扰素，不加病毒)，倒置显微镜下逐日观察细胞病变，待阳性对照孔出现75 %病变时判定结果。
[0020]实验结果表明:(1)阴性对照孔中的细胞未产生任何病变，说明本实施例得到的干扰素本身对细胞没有毒害作用；(2)经14倍稀释的猪α干扰素能100%抑制细胞病变，而17倍稀释的干扰素有6个孔出现细胞病变，由上述结果得出猪α干扰素抗VSV比活性为 3.82X 107U/mgo
[0021]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作出的简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明权利要求的保护范围。
【主权项】
1.一种猪α干扰素基因，其特征在于:其DNA序列如下所示:tgtgacctacctcaaacgcattctctagctcatacaagagcactaagactgctggcacaaatgagaagaatctcccctttctcttgtctggatcatagaagagacttcggaagtccacacgaagcttttggaggtaaccaagttcaaaaggctcaagctatggcattggtacatgaaatgctgcagcaaactttccaacttttctccaccgaaggttcagctgctgcatgggatgaatctcttttgcaccaattttgtaccggtttggatcagcagttgagagacttggaagcttgcgttatgcaggaagctggcttagaagggactccattgttagaagaggattctatattggccgttcgaaaatactttcacaggttaactttgtatcttcaggagaagagttatagtccctgcgcctgggagattgtccgtgccgaggtgatgaggtccttttcttcatcacgtaatcttcaggatcgtttacgaaagaaagagtaa。
2.一种如权利要求1所述的猪α干扰素基因的合成方法，其特征在于它按照以下步骤顺序进行: (1)登录GeneBank，查找编码猪α干扰素成熟蛋白的基因序列； (2)将猪α干扰素的编码密码子与毕赤酵母Χ-33偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性，将猪α干扰素密码子替换为毕赤酵母Χ-33偏好的密码子； (3)将替换后的序5’、3’端分别加上EcoR1、XbaI酶切位点，进行全基因合成，并连入真核表达质粒pGAPZ a A中，得到重组真核表达质粒pGAPZ a A-1FN- α。
【专利摘要】本发明公开了一种猪α干扰素基因及其合成方法，提供的基因能够实现干扰素在毕赤酵母的高表达，获得具有抗病毒活性的猪α干扰素蛋白；其合成方法所制备出的猪α干扰素基因抗 VSV活性为3.82×107U/mg。本发明的合成方法采用在不改变猪α干扰素氨基酸序列的基础上设计其编码核酸序列，使阅读框内的每个密码子都采用毕赤酵母偏爱的密码子；在人工合成步骤中设计的编码核酸。后将合成的核酸插入适当的表达载体，构建重组表达载体；最后将构建的重组表达载体转化适当的毕赤酵母进行诱导表达，结果显示猪α干扰素在毕赤酵母的高表达，获得具有抗病毒活性的猪α干扰素蛋白。本发明适用于猪α干扰素的合成。
【IPC分类】C12N15-81, C12N15-21, C12R1-84, C12N15-10
【公开号】CN104878017
【申请号】CN201510264558
【发明人】符雷, 郗洪生, 田柳, 蒋德意
【申请人】江苏恒丰强生物技术有限公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年5月22日