有效抑制小鼠KCNA3基因表达的DNA、shRNA及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体是涉及有效抑制小鼠 KCNA3基因表达的DNA、 shRNA及其应用。
【背景技术】
[0002] KCNA3基因编码KCNA3离子通道。KCNA3离子通道属于电压门控钾离子通道家族 (简称Kv)，Kvl亚型，属于一类延迟整流钾离子通道，可以被电压激活而选择性通透钾离子 (K+)。KvL 3离子通道在淋巴细胞、癌细胞和神经细胞上均有表达。人类KCNA3通道是T 淋巴细胞膜上的一种主要离子通道，研宄表明，KCNA3可能参与人类炎症性神经细胞疾病。 KCNA3在目前的研宄中，被广泛应用为炎症性神经系统疾病的治疗靶点。
[0003] RNA干扰是由细胞内源自行产生或者由人为外源导入的RNA片段介导发生的一种 基因转录水平或者基因转录后水平的基因沉默现象。随着RNA干扰（RNAi)技术的不断深 入发展，RNAi已经成为基因功能研宄和基因治疗领域最热门的技术之一。目前应用于哺乳 动物的RNAi方法通常为：体外化学合成s iRNA (短干扰RNA)，再将合成好的s iRNA转入 细胞。然而，这种常见的方法转染效率较低、RNA结构易降解、且沉默时间极短（仅为3-5 天）。shRNA技术克服了这些缺点，可以高效率且长期稳定地在细胞株内沉默靶标基因，其 沉默效果不受到细胞分裂影响。此外，shRNA慢病毒载体感染目标细胞株后，可以通过荧光 筛选或者抗生素筛选等方式，避免未感染的细胞干扰后续实验。
[0004] 本发明针对KCNA3基因设计特异性的shRNA序列，构建相应的慢病毒感染系统，为 以后深入研宄KCNA3离子通道的功能奠定了技术基础，也可以应用于炎症性神经系统疾病 治疗的研宄，具有重要的应用前景和经济价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是提供一种有效抑制KCNA3基因表达的shRNA和相应的DNA序 列。
[0006] 实现上述目的的技术方案如下。
[0007] 一种编码抑制KCNA3基因表达的shRNA的DNA序列，所述DNA序列为5'至3'碱 基组成依次由SEQ ID NO. 1、环结构序列、SEQ ID NO. 1的反向互补序列构成的单链或者双 链；或所述DNA序列为5'至3'碱基组成依次由SEQ ID NO. 2、环结构序列、SEQ ID NO. 2的 反向互补序列构成的单链或者双链。
[0008] 在其中一个实施例中，所述环结构序列为ttcaagaga或tctcttgaa。
[0009] 一种抑制KCNA3基因表达的shRNA，其为由上述DNA序列编码得到的RNA序列。
[0010] 本发明的另一目的是提供一种慢病毒载体质粒及其制备方法。
[0011] 具体技术方案如下。
[0012] 含有上述编码抑制KCNA3基因表达的shRNA的DNA序列的慢病毒表达载体质粒。
[0013] 含有上述的编码抑制KCNA3基因表达的shRNA的DNA序列的慢病毒表达载体质粒 的制备方法，包括以下步骤：
[0014] 1)将引物 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8,或 SEQID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12分别加水稀释后，退火，得到两对可以 编码shRNA的双链DNA ;
[0015] 2)分别将双链DNA与酶切好的载体用T4连接酶接，转化，筛选得到重组质粒，即得 慢病毒表达载体质粒。
[0016] 本发明的另一目的是提供一种慢病毒。
[0017] 具体技术方案如下。
[0018] 含有上述慢病毒表达载体的慢病毒。
[0019] 本发明的另一目的是提供一种KCNA3基因表达抑制的细胞株及其制备方法。
[0020] 具体技术方案如下。
[0021] 含有上述慢病毒的可传代的KCNA3基因表达抑制的细胞株。
[0022] 含有上述慢病毒的可传代的KCNA3基因表达抑制的细胞株的制备方法，包括如下 步骤：
[0023] 1)将慢病毒表达载体质粒与辅助质粒共转染至293T细胞中，收集，过滤，得到含 有包装好的慢病毒颗粒的病毒液；
[0024] 2)在目标细胞（目标细胞为小鼠细胞，如小鼠神经干细胞等）培养基中加入病毒 液，培养后筛选得到可传代的KCNA3表达抑制的细胞株。
[0025] 在其中一个实施例中，步骤2)为：在细胞培养基中加入病毒液，培养3-5天后于荧 光显微镜下观察目标细胞的荧光情况；带有红色荧光的细胞即为被病毒感染的细胞；随后 将感染后的目标细胞扩增培养，使用活细胞流式细胞仪筛选带有红色荧光的细胞，即可得 到纯度较高的KCNA3沉默细胞株。
[0026] 本发明的另一目的是提供一种上述DNA或shRNA的应用。
[0027] 具体技术方案如下。
[0028] 上述编码抑制KCNA3基因表达的shRNA的DNA或上述shRNA序列在抑制
[0029] KCNA3基因表达中的应用。
[0030] 本发明相对于现有技术具有如下优点及效果：
[0031] 1)本发明所述的选择性沉默KCNA3基因的所述DNA所编码的shRNA能够在mRNA 水平上高效率地抑制细胞中KCNA3蛋白的表达，且沉默效果稳定，细胞的增殖分裂不对其 沉默效果产生影响。
[0032] 2)本发明可得到纯度较高的KCNA3沉默细胞株，有效降低后续实验中源于KCNA3 未被沉默细胞的干扰。
[0033] 3)本发明提供的shRNA_KCNA3慢病毒载体不仅适用于体外培养的细胞体系，也适 用于动物模型等体内实验。因此，本发明对于深入研宄KCNA3蛋白的功能和炎症性神经系 统疾病的治疗，均具有重要的科学意义和应用前景。
【附图说明】
[0034] 图I :shRNA重组慢病毒载体沉默靶细胞KCNA3基因的工艺流程；
[0035] 图2 :病毒感染的小鼠神经干细胞经流式分选后的荧光对比图；
[0036] 图3 :荧光定量PCR实验中PCR产物溶解曲线；
[0037] 图4 :shRNA慢病毒感染后小鼠神经干细胞中KCNA3的mRNA表达水平。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合【具体实施方式】和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式 不限于此。
[0039] 应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室 手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0040] I. ShRNA序列的设计与编码shRNA序列的DNA序列的合成
[0041] shRNA 序列设计：通过 NCBI 数据库(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/gene/)查询 小鼠 KCNA3基因的mRNA信息（NM_008418. 2)，设计shRNA序列。然后进一步经过筛选后， 选择了 4条靶向小鼠 KCNA3基因的shRNA序列，在此基础上再增加一条Nonsense(NS)对 照组。4条shRNA序列靶向KCNA3基因的位点分别为：NM_008418:1689-1709,1537-1557， 588-608,1521-1541。shRNA 靶向的 DNA 序列如下表：
[0042]
【主权项】
1. 一种编码抑制KCNA3基因表达的shRNA的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列为 5'至3'碱基组成依次由SEQ ID NO. 1、环结构序列、SEQ ID NO. 1的反向互补序列构成的 单链或者双链；或所述DNA序列为5'至3'碱基组成依次由SEQ ID NO. 2、环结构序列、SEQ ID NO. 2的反向互补序列构成的单链或者双链。
2. 根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述环结构序列为ttcaagaga或 tctcttgaa〇
3. -种抑制KCNA3基因表达的shRNA，其特征在于，其为由权利要求1或2所述的DNA 序列编码得到的RNA序列。
4. 含有权利要求1或2所述编码抑制KCNA3基因表达的shRNA的DNA序列的慢病毒表 达载体质粒。
5. 权利要求4所述的慢病毒表达载体质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将引物 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、与 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8,或 SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、与SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12分别加水稀释后，退火，得到两对双 链 DNA ; 2) 分别将双链DNA与酶切好的载体用T4连接酶接，转化，筛选得到重组质粒，即得慢病 毒表达载体。
6. 含有权利要求4所述慢病毒表达载体质粒的慢病毒。
7. 含有权利要求6所述慢病毒的KCNA3基因表达抑制的细胞株。
8. 权利要求7所述细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 将慢病毒表达载体质粒与辅助质粒共转染至293T细胞中，收集，过滤，得到含有包 装好的慢病毒颗粒的病毒液； 2) 在目标细胞的培养基中加入上述病毒液，培养后筛选得到可传代的KCNA3基因表达 抑制的细胞株。
9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤2)为：将病毒液加入细胞培养 基进行培养，培养3-5天后于荧光显微镜下观察荧光情况；带有红色荧光的细胞即为被病 毒感染的细胞；随后将感染后的目标细胞扩增培养，使用活细胞流式细胞仪筛选带有红色 荧光的细胞，即得到纯度较高的KCNA3沉默细胞株。
10. 权利要求1或2所述的DNA序列，或权利要求3所述的shRNA在抑制KCNA3基因表 达中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种有效抑制KCNA3基因表达的shRNA、编码该shRNA的DNA序列及其应用，所述编码抑制KCNA3基因表达的shRNA的DNA序列为5’至3’碱基组成依次由SEQ ID NO.1、环结构序列、SEQ ID NO.1的反向互补序列构成的单链或者双链；或所述DNA序列为5’至3’碱基组成依次由SEQ ID NO.2、环结构序列、SEQ ID NO.2的反向互补序列构成的单链或者双链。本发明还公开了含有上述DNA序列的慢病毒表达载体、慢病毒、细胞株及其制备方法。本发明所述的选择性沉默KCNA3基因的shRNA能够在mRNA水平上高效率地抑制细胞中KCNA3蛋白的表达，且沉默效果稳定，细胞的增殖分裂不对其产生影响。
【IPC分类】C12N15-113, C12N15-867, C12N5-10
【公开号】CN104878007
【申请号】CN201510148971
【发明人】李志远, 周雨叶, 萧卓, 侯国强
【申请人】中国科学院广州生物医药与健康研究院
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年3月31日