线粒体荧光染色剂3-杂芳基取代-2h-吲唑类衍生物的制备及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一类专一性标记线粒体的荧光化合物3-杂芳基取代-2片吲唑类衍生 物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 线粒体是绝大多数真核细胞中重要的细胞器，除了为细胞提供能量以外，还参 与诸多生理活动，如细胞分化、细胞增殖、细胞间信息传递和细胞凋亡等过程，同时还具 有调控细胞生长和细胞周期的能力[SM:(a)Green，D.R.;Reed，J.C.5bie/7c e· 1998, 281, 1309; (b) Li, Η. ; Kolluri, S. K. ; Gu, J. et al. Science. 2000, 289, 1159; (c) Maechler, P. ; ffollheim, C. B. Nature. 2001, 414, 807; (d) Henze, K.; Martin, ff. Nature. 2003, 426, 127; (e) Green, D. R. ; Galluzzi, L. ; Kroemer, G. Science. 2011, 333, 1109; (f) NunnariI, J. ; Suomalainen, A. Cell. 2012, 148, 1145; (g) Friedman, J. R. ; Nunnari, J. 2014,卻沃 335.]。专一性跟踪检测 细胞内线粒体的形态及分布有利于深入了解和研宄许多相关的生理活动[参见：（a) Hoye, A. T. ; Davoren, J. E. ; ffipf, P. ; Fink, M. P. ; Kagan, V. E. Acc. Chem. Res. 2008, 41, 87; (b) Yousif, L F. ; Stewart, K. M. ; Kelley, S. 0. ChemBioChem. 2009, 10, 1939.]。近年来，由于其高灵敏度、高分辨率以及快速的响应时间等特性，荧光成像技术已 经被广泛应用于生物学和医学等众多领域之中，设计和开发对线粒体具有专一性识别作用 的焚光探针倍受关注[参见：（3)1^￥3206，￥.;311；[1]1083￥3，！1.;331：0，4.6七31.4/7供见 Chem. Int. Ed. 2011, 50, 5478; (b) Zhang, T. ; Zhu, X. ; Cheng, C. C. ff. et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 20120; (c) Pierroz, V. ; Joshi, T. ; Leonidova, A. et al. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 20376; (d) Leung, C. ff. T. ; Hong, Y. ; Chen, S. et al. J办?. CXe?. 5bc. 2013，7J5； 62.]。目前，市售的线粒体荧光标记试剂种类 较少，化合物结构相对复杂，光稳定性有待提升，价格普遍昂贵。更重要的问题在于，大多数 市售线粒体荧光标记试剂发射绿光和黄光，而发射红光的标记试剂相对很少。相比于绿色 和黄色荧光标记试剂，红色甚至近红外（发射波长范围：600~900 nm)荧光试剂在生物体内 具有由于更小的光损伤、更低的背景噪音干扰、更少的光散射以及更深的组织穿透能力等 特性，[参见：（a) Weissleder，R. Nat. Biotechnol. 2001, 19, 316; (b) Frangioni, J. V. Curr. Opin. Chem. Biol. 2003^ 7, 626/ (c) Hilderbrand, S. A. ; ffeissleder, R. Curr. Opin. Chem. Biol. 2010, 14, 71; (d) Guo, Z. ; Park, S. ; Yoon, J. et al. Chem. Sci. Rev. 2014, 4i, 16; (e) Lukinaviius, G. ; Umezawa, K. ; Olivier, N. et al. Nat. Chem. 2013, 5, 132; (f) Choi, H. S. ; Gibbs, S. L ; Lee, J. H. et al. 2013，J7，148.]，使得设计和开发结构简单且具有长波长荧光发射的 新型线粒体荧光标记试剂迫在眉睫。
[0003] 联杂芳基类荧光化合物由于具有可调控的发射波长，大的斯托克斯位移以及 较强的荧光发射等光物理特性，已经引起了人们的高度关注[参见：(a) Nesterov，E. E. ; Skoch, J. ; Hyman, B. T. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 5452; (b) ffakamiya, A. ; Taniguchi, T. ; Yamaguchi, S. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 3170; (c) Park, H. J. ; Lim, C. S. ; Kim, E. S. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 2673; (d) Fukazawa, A. ; Kishi, D. ; Tanaka, Y. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 12091; (e) Kim, G. H. ; Haider, D. ; Park, J. et al. Angew. Chem. 及/. 2014，9271.]。许多基于联杂芳基结构为核心的荧光染料也已经相继上 市。吲唑类结构单元不仅广泛存在于众多天然产物、药物分子以及生物活性分子中[参 见：Schmidt, A. ; Beutler, A. ; Snovydovych, B.及/r. J (??; 2008, 4073·]， 在最近几年内也逐渐成为了构筑新型小分子荧光团的重要骨架之一[参见：（a) Ma，F.; Zhou, N. ; Zhu, J. et al. Eur. Polym. J. 2009, 45, 2131; (b) Vernekar, S. K. V.; Hallaq, H. Y. ; Clarkson, G. et al. J. Med. Chem. 2010, 53, 2324; (c) Lian, Y.; Bergman, R. G. ; Lavis, L. D. et al. J CXe?. 5bc. 2013, 7122·]。由于其 相对缺电的π-共轭特性，吲唑与富电杂环（噻吩、苯并噻吩、呋喃、苯并呋喃、吲哚、吡咯） 偶联所得到的联杂芳基结构单元存在明显的分子内电荷转移效应（ICT)。外加可调控电子 能力的助色基团的辅助可以有效地构筑具有更加强烈的ICT效应的小分子荧光团，使其发 射红色荧光甚至近红外荧光。
[0004] 然而，联杂芳基类荧光化合物仍然主要通过传统的环加成反应或过渡金属催化的 C-X/C-M(X =卤素或拟卤素 ，M = SnR3, 8((?)2等）偶联反应来构筑。这两类反应通常存 在合成路线较长、步骤较多、反应条件苛刻、操作较为繁琐、原材料难于获得、官能团容忍性 较差以及副产物易造成环境污染等缺点，在很大程度上限制了快速合成具有优异光物理特 性的、对线粒体有专一性荧光显影作用的联杂芳基类化合物。本专利的目的不是"多样化的 筛选"，而是直达目标。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于开发一类基于3-杂芳基取代2片吲唑骨架的专一性标记线粒 体的荧光探针试剂：利用高效、简洁以及环境友好的C-H/C-H交叉氧化偶联反应，快速合成 3_杂芳基取代2片吲唑类荧光分子库，并将其运用于专一性标记细胞内线粒体的领域中。
[0006] 本发明利用2片吲唑类衍生物与富电杂环C-H/C-H的交叉氧化偶联反应，高效、快 速地构建具有各种荧光发射波长的荧光分子3-杂芳基取代2片吲唑类衍生物。其结构通 式见附图1。
[0007] 本发明解决该问题的技术方案是采用以下的原料及制备路线，如附图2: (1) 在干净、干燥的反应器中加入2片吲唑类衍生物、富电杂环、催化剂、氧化剂、添加 剂和溶剂，室温下混合均匀，随后在无水无氧条件下一 40~160 °C反应0. 1~720小时； (2) 反应完成后将反应管冷却至室温，加入二氯甲烷将反应体系稀释，再经硅藻土过 滤，并用二氯甲烷洗涤，合并滤液，减压移去溶剂，剩余物用硅胶柱层析分离纯化，真空干 燥。
[0008] 其中，2片吲唑类衍生物的结构通式为：
其中R1和R 2分别为氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、羰基、硝基、取代芳基和取代杂芳基中 的一种或两种。其中取代芳基和取代杂芳基中的取代基团为烷基、烷氧基、酰胺基或羰基中 的一种或几种。其中烷基、烷氧基、烷基氨基、酯基、酰胺基或羰基的碳链为碳个数为〇~40 的直链、支链或环链。
[0009] 富电杂环的结构通式为以下一种：
其中R3和R4基团分别为氢、卤素、烷基、苄基、烷氧基、酯基、酰胺基、羰基、醛基、氰基或 取代芳基的一种或两种。其中烷基、烷氧基、酯基、酰胺基或羰基中的碳链为碳个数为〇~40 的直链或支链。
[0010] 步骤（1)中，催化剂为钯碳、四（三苯基膦）钯、醋酸钯、氯化钯、二（乙腈）