一种早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法，特别涉及一种采用烟碱特异引物PCR扩增且根据特征带谱早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法，属于烟草种植技术领域。
【背景技术】
[0002]已有研宄表明，普通烟草主要包括四种生物碱:烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱四种。普通烟草属于烟碱积累型，烟碱占总生物碱含量的90%以上，降烟碱是第二大生物碱，但一般也只占总生物碱含量的2-5%，另外两种生物碱含量极低。降烟碱亦称为去甲基烟碱，主要由烟碱在去甲基化酶的作用下脱甲基形成。虽然降烟碱含量较低，但由于降烟碱易于在烟叶调制和陈化过程中在微生物和亚硝酸盐联合作用下发生亚硝化反应，生成具有致癌作用的烟草特有亚硝胺(TSNAs)，另外，也会降低烟叶香味品质，影响烟叶使用价值。卷烟中有25-45%的TSNAs直接来自于烟叶，因此，降低烟叶TSNAs含量、提高卷烟安全性已成为国际烟草届的共识和关注焦点。
[0003]自上个世纪50年代起，研宄人员开始关注烟碱转化的遗传控制机理，研宄表明，该性状受两个连锁的显性基因位点(；和Ct控制，分别来源于烟草祖先中林烟草和绒毛状烟草，因连锁而呈单基因显性遗传特点。随着生物化学和分子生物学技术的进步，首先确认了烟碱在烟碱去甲基化酶(nicotine N-demethylase, NND)的催化下去甲基合成降烟碱的生化过程；另外，采用群体遗传学分析、化学诱变、芯片杂交、同源克隆、酵母表达、转基因等技术先后克隆和分析了五个控制烟碱转化过程的关键基因:CYP82E2、CYP82E3、CYP82E4vl、CYP82E5v2和CYP82E10，其中前两个基因在普通烟草中因进化过程中发生替换突变而失去了编码有活性的NND酶的功能，CYP82E4vl是控制烟碱转化最主要的基因，属于衰老诱导型基因，CYP82E5v2和CYP82E10是烟碱转化的次要影响基因，分别在鲜叶和根部特异表达。
[0004]2010年，中国烟草基因组计划正式启动，2013年底完成林烟草、绒毛状烟草和栽培烟草三个烟草的全基因组测序和组装，本发明人利用烟草全基因组数据，对已克隆的五个基因在自有高、低烟碱转化极端表型烟草材料中进行了基因组和表达谱的多态性检测，结果未发现可靠多态性和显著的表达水平差异，这表明自有材料中可能存在新的影响烟碱转化的基因位点，采用SRAP和SSR标记对高、低烟碱转化极端表型材料进行了集团分离分析法(Bulked Segregat1n Analysis，BSA)，其中有I个SSR标记在这两个材料之间表现出稳定的遗传多态性，且为共显性标记，所扩增的PCR产物大小分别为325bp和256bp，相差69bp，用浓度为2%的琼脂糖凝胶可清晰展示其差异，该SSR标记成为本发明中所使用的烟碱转化特异引物，自有材料的基因型和表现型吻合度验证表明，该特异引物稳定可靠，可用于高、低烟碱转化材料筛选。
[0005]目前，育种上常用团棵期乙烯诱导烟碱转化的方法来提前鉴定烟株烟碱转化高低属性(专利:一种诱导烟草烟碱提前转化方法及其应用，ZL2007100540828)，这样可以节约时间和经济成本，具体操作方法简述为:取团棵期烟叶(由下至上取7-10叶位定型叶2-3片)，喷施I %的乙烯水溶液后保湿晾制，4至6天烟叶完全变黄后，及时去掉主脉，60°C烘干，粉碎制样检测烟碱和降烟碱含量，计算出烟碱转化率，以此判断烟株的烟碱转化高低属性，再进行田间转化株剔除。本方法虽然可靠有效，但存在以下不足:1、取样时期在移栽后的团棵期，仍然偏迟，剔除转化株后浪费了田地，且难以保证目标群体大小；2、需化学药品诱导方可；3、鉴定结果受环境因素影响:比如药品浓度、调制温度和时间、化学检测的影响因素等。因此，虽有较好的借鉴作用，但仍不够高效与及时，无法满足现实的需求。
[0006]烟碱转化率计算公式为:烟碱转化率=100*降烟碱含量/(降烟碱含量+烟碱含量)，本发明中的高烟碱转化株指的是烟碱转化率>50%的烟株，低烟碱转化株指的是烟碱转化率〈5%的烟株。
【发明内容】
[0007]本发明为解决现有技术的不足提供一种早期鉴定和筛选烟草高和低烟碱转化株的方法，具体为一种早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法，将鉴定时期从团棵期提前到播种前，而且鉴定手段简单，精准高效，试验效果只决定于其内在的遗传物质而不受外部环境条件的影响，这为提高烟叶安全性和改善烟叶品质，为低危害烟叶开发奠定了坚实的理论与技术基础。
[0008]一种早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法，具体步骤依次如下:
[0009]A、在超净工作台上，将用于高和低烟碱转化株筛选的烟草种子(含对照品种)放入已标识的2ml无菌离心管中，倒入浓度为70-75%的乙醇进行表面消毒50_60s，无菌水漂洗I次，时间为3-5min，用移液枪吸走无菌水，再用饱和次氯酸钙(Ca(ClO)2)溶液消毒8-10min，封盖上下翻动多次以充分消毒，无菌水漂洗多次以去除残留的Ca(ClO)2溶液，用移液枪吸走无菌水后，用去尖头的枪头吸取消毒后的种子播种于MS固体培养基上，往培养基中加l_2ml无菌水，保证种子的正常吸胀发芽，消毒、封口后轻轻摇晃培养基，使种子在培养基中分布均匀，标识后置于光照培养室发芽；
[0010]B、待烟苗长出5-6片真叶后，每个材料各取3株，每株采集1-2片真叶，采用CTAB小样法提取基因组总DNA，纯化后-20°C保存备用；
[0011]C、基因组DNA的PCR反应:用紫外分光光度计测定B步骤中DNA的浓度，然后将其浓度稀释成50-60ng/ μ L作为DNA反应模板进行PCR反应，所采用的烟碱转化特异引物序列:
[0012]正向引物:5’-ATTGGCCCAATTGCCAAATGGATTACTGC-3’，
[0013]反向引物:5’-TGCGAGTCGAGCGTACTCAATCTAT-3’ ；
[0014]D、PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳及电泳结果的读取:将步骤C中所获得的PCR扩增产物与溴酚蓝-甘油溶液以4:1的体积比混合，注入浓度为2%的琼脂糖凝胶样品槽中，同时注入10bp的DNA ladder，通电开始电泳，结束后取出凝胶，清除表面的溴化乙锭(EB)溶液，然后将胶板放入凝胶成像系统的观察板上，在波长为254nm的紫外灯下进行观察，拍照并记录电泳图谱以备比较分析；
[0015]E、烟草高和低烟碱转化株筛选:用C步骤中的烟碱转化特异引物PCR扩增高烟碱转化，标准为:烟碱转化率>50%，烟碱转化率=100*降烟碱含量/ (降烟碱含量+烟碱含量)，下同；低烟碱转化，标准为:烟碱转化率〈5%，下同，对照品种获得的PCR特征带谱作为鉴定和筛选高、低烟碱转化株的依据。凡能扩增出与高烟碱转化对照材料一致的特征带谱的烟草材料可被确定为高烟碱转化株，同理，凡能扩增出与低烟碱转化对照材料一致的特征带谱的烟草材料可被确定为低烟碱转化株，除此两种情况之外的材料不予选择。被筛选出的高、低烟碱转化烟苗保留备用。
[0016]在步骤A中的饱和Ca(ClO)2溶液浓度为10%，其消毒时间为8_10min ;无菌水冲洗2-3次，每次为3-5min。
[0017]在步骤C中的烟碱转化特异引物序列为:
[0018]正向引物:5’-ATTGGCCCAATTGCCAAATGGATTACTGC-3’，
[0019]反向引物:5’-TGCGAGTCGAGCGTACTCAATCTAT-3’ ；
[0020]PCR 反应体系为:2.5 μ L 带(NH4) #04的 1X 反应缓冲液，MgCl 22.0mmoI/L, dNTPs200 μ mol/L，1.2U Tag酶，50ng模板DNA，正向和反向引物各0.45 μ mol/L，不足部分用ddH20补足，总体积为25 μ L ;反应程序为:第一阶段在94°C环境下反应4min，第二阶段在940C的环境下反应30s，第三阶段先在55°C环境下反应35s，然后在72°C的环境下反应90s，第二和第三阶段共循环28次；第四阶段在72°C环境下反应4min，并在4°C的环境下保存。
[0021]在步骤D中，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳过程中，在样品进胶前用6.5V/cm的电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压不高于5V/cm。
[0022]本发明所涉及的一种早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法，具有精准高效、操作简便、易于推广，可用于播种前的烟草高、低烟碱转化株的筛选，可极大提高品种群体尤其是亲本群体的非转化株比例，可用于烟草亲本种子提纯和种子烟碱转化性状鉴定，可降低平均烟碱转化率，提高烟叶质量，为早期鉴定和筛选低有害物质特有亚硝胺(TSNAs)烟株开辟了一条新的高效途径。本发明适用范围于白肋烟、马里兰烟、香料烟、烤烟和其它地方晾晒烟的常规种和雄性不育杂交种的品种选育和原种提纯。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0024]实施例1、白肋烟高和低烟碱转化株的早期筛选，其具体步骤依次如下:
[0025]A、在超净工作台上，将用于高和低烟碱转化株筛选的白肋烟品种10份(含2份对照品种:B37高烟碱转化材料，转化率为85% ；B37低烟碱转化材料，转化率为3.1% )分别放入已标识的2ml无菌离心管中，倒入浓度为70%的乙醇进行表面消毒60s，无菌水漂洗I次，时间为3min，用移液枪吸走无菌水，再用浓度为10%的饱和次氯酸钙(Ca(ClO)2)溶液消毒8min，封盖上下翻动多次以充分消毒，无菌水漂洗3次，每次3min，以去除残留的Ca(ClO)2溶液，用移液枪吸走无菌水后，用去尖头的枪头吸取消毒后的种子播种于MS固体培养基上，往培养基中加1.5ml无菌水，保证种子的正常吸胀发芽，消毒、封口后轻轻摇晃培养基，使种子在培养基中分布均匀，标识后置于光照培养室发芽培养；
[0026]B、待烟苗长出5片真叶后，每个材料各取3株，每株采集1-2片真叶，采用CTAB小样法提取各烟草品种基因组总DNA，纯化后-20°C保存备用；
[0027]C、基因组DNA的PCR反应:用紫外分光光度计测定B步骤中DNA的浓度，然后将其浓度稀释成50ng/ μ L作为DNA反应模板进行PCR反应，所采用的烟碱转化特异引物序列:
[0028]正向引物:5，-ATTGGCCCAATTGCCAAATGGATTACTGC-3，，
[0029]反向引物:5’ -TGCGAGTCGAGCGTACTCAATCTAT-3 ’ ；
[0030]D、PCR扩增产物的琼脂糖