基因序列进行了优化。优化的原则主要是根据大肠杆菌 的密码子偏好性重新设计了 glA2的基因序列，同时还对N端的mRNA的二级结构进行了 6 个核苷酸的优化，最终获得如SEQ ID N0 :1显示的基因序列。该基因序列与野生型基因序 列相似性仅为75. 2%，与黄热厌氧芽孢杆菌云南亚种E13T中0 -葡萄糖苷酶的基因序列相 似性为74.9%。在该基因两端加Ndel和Xhol限制酶切位点。把该基因的文本序列送至生 物公司（上海生工生物科技有限公司）合成。合成的glA2基因序列克隆在载体pUC57上， 插入位点为T-A克隆，受体菌为大肠杆菌DH5a菌株。其中本发明的葡萄糖苷酶glA2 的核苷酸序列为SEQ ID NO :1，氨基酸序列为SEQ ID NO :2。
[0029] 实施例3
[0030] P -葡萄糖苷酶glA2的表达载体pET22b-glA2的构建
[0031] 将含有glA2基因的克隆载体pUC57和表达质粒pET22b分别用Ndel和Xhol进行 双酶切，酶切产物电泳分离后，回收glA2基因片段和表达质粒pET22b。加入T4DNA连接酶 16。°C过夜连接。连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选出阳性克隆，获 得重组表达质粒pET22b-glA2。
[0032] 实施例4
[0033] P_葡萄糖苷酶glA2的低溶氧诱导表达
[0034] 要实现0 -葡萄糖苷酶glA2的活性的可溶性的表达，诱导过程中的低溶氧控制十 分关键。将含有pET22b-glA2的大肠杆菌BL21 (DE3)接种在含有50ug/ml氨苄青霉素的LB 液体培养基，37°C培养。摇瓶或发酵罐培养时的转速控制为200-220r/min。当大肠杆菌培 养液的0D600达到0. 5左右时，加入0. 8mM IPTG (异丙基-0 -D-硫代吡喃半乳糖苷），然后 将转速降低为80-lOOr/min，诱导6-8h。整个诱导表达过程中培养基的溶氧值（D0)小于等 于10%。此外，也可以通过增加装液量、减少通气量（发酵罐培养时）等方法同样实现溶氧 值（D0)小于等于10%。
[0035] 实施例5
[0036] 0 -葡萄糖苷酶glA2的纯化
[0037] 将诱导表达后的大肠杆菌培养液6000g离心5min，收集沉淀细胞。加入0. 5倍体 积的Binding Buffer重悬，超声波破碎细胞。然后12000g离心5min，上清即为粗酶液。将 粗酶液在60°C孵育20min，大量的大肠杆菌本身不能耐受高温的蛋白会变性沉淀。然后在 12000g离心15min，去除沉淀的变性蛋白。将所得上清液体经过Ni-NTA柱层析进行纯化。 洗脱液中咪唑浓度为60mM，洗脱10个柱体积。收集的蛋白液用SDS-PAGE电泳鉴定纯度，结 果如图2所示。
[0038] 实施例6
[0039] 0 -葡萄糖苷酶glA2的活性测定
[0040] 0 _葡萄糖苷酶的活性测定方法是以pNPG (对硝基苯-0-D-吡喃葡萄糖苷）为 底物进行酶解，底物水解释放出来的P-硝基苯酚（PNP)可直接在415nm测定。标准曲线以 pNP为标准测定。一个标准反应体系为300 y 1，包括10 y 1酶液、15 y 1的底物pNPG (5mM)和 275 yl磷酸氢二钠-柠檬酸（50mM，pH7. 5)缓冲液。酶在50°C反应5min，加入300 yllmol/ L的Na2C0j#止反应，在415nm下测定吸光值。一个标准酶活单位（U)定义为每分钟释放 出1 ymol pNP所需的酶量。纯化的0 -葡萄糖苷酶比活为62. 2U/mg。
[0041] 实施例7
[0042] 0-葡萄糖苷酶glA2的酶学性质
[0043] 最适反应温度和最适反应pH
[0044] 根据实施例6描述的方法，在0-80°C温度范围内分别测定glA2的活性，结果如图 4所示。glA2在0-70°C起作用，最适温度为50°C。
[0045] pH4. 0-8. 0采用的是50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；pH8. 0-10. 5采用的是甘氨 酸-氢氧化钠缓冲液。在50°C根据实施例6描述的方法，测定最适反应pH，结果如图3所 示。glA2的pH范围为4. 5-10. 5,最适pH为7. 5, pH 8.0和9.0时保持最适pH时有93% 和53 %酶活。
[0046] 温度稳定性和碱性pH的稳定性
[0047] glA2在50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH7. 5)中，50°C孵育14h，期间每隔一 定时间取出10 y 1酶液，据实施例6描述的方法测定残留酶活，结果如图5所示。glA2的温 度稳定性非常好，50°C时的半衰期为13h。
[0048] 室温下，将glA2分别孵育在pH 7. 0 (50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液）、pH8. 0、 9. 0和10. 0 (50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）24h。期间每隔一定时间取出10 y 1酶液，据实 施例6描述的方法测定残留酶活，结果如图6所示。glA2的碱稳定性很好，在pH 8.0,9.0 和10. 0孵育24h后依然保持92,99和97%的酶活。
[0049] 葡萄糖对glA2活性的影响
[0050] 在标准反应体系中分别添加 0? 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、1. 25、1. 5、1. 75 和 2.Omol/L 的葡萄糖，据实施例6描述的方法测定酶活，结果如图7所示。低于1. 75mol/L的葡萄糖都 能增强酶活；当葡萄糖浓度为0. 4mol/L时，酶活最高达到136. 8U/mg，为无葡萄糖存在时的 2. 2倍。存在2.Omol/L的葡萄糖时，酶活依然保留了 76%。这个结果说明glA2是一个能 耐受极高浓度的糖的葡萄糖苷酶。
【主权项】
1. 一种耐高糖耐碱的P -葡萄糖苷酶glA2,其基因序列如SEQ ID NO :1所示，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :2所示。2. 含有权利要求1所述基因的P _葡萄糖苷酶重组表达载体。3. 含有权利要求1所述基因的重组表达载体pET22b-glA2。4. 一种产生P -葡萄糖苷酶的重组菌，该重组菌内导入了权利要求1所述的基因。5. 根据权利要求4所述重组菌，其特征是该重组菌为大肠杆菌BL21 (DE3)菌株。6. 根据权利要求5所述重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株的低溶氧诱导表达方法。其特征 是，LB培养基，37°C，整个诱导表达过程中培养基的溶氧值（DO)小于等于10%。7. 根据权利要求6所获得的0 -葡萄糖苷酶在糖降解中的应用，其特征是，催化环境中 存在高浓度葡萄糖，或者催化环境是偏碱性。
【专利摘要】本发明公开了一种β-葡萄糖苷酶glA2，该酶的基因序列如SEQ？ID？NO：1所示；该基因序列编码的氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示。与现有的β-葡萄糖苷酶相比，本发明提供的β-葡萄糖苷酶具有以下特点：(1)葡萄糖能显著提高酶活。低于1.75mol/L的葡萄糖都能增强酶活；当葡萄糖浓度为0.4mol/L时，酶活最高达到136.8U/mg，为无葡萄糖存在时的2.2倍；(2)酶的碱稳定性很好，在pH？8.0，9.0和10.0孵育24h后依然保持92％，99％和97％的酶活。该酶可以应用于存在高浓度葡萄糖或者同时为碱性的催化环境中。
【IPC分类】C12N9/42, C12N1/21, C12R1/19, C12N15/56, C12N15/70
【公开号】CN105039285
【申请号】CN201410668699
【发明人】彭惠, 易路, 张销寒, 高毅
【申请人】安徽大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2014年11月16日