一种利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质化学领域技术领域，具体的说是一种利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]全国污染状况调查公报显示，全国土壤污染总超标率为16.1%，其中重金属污染占80%以上。土壤中的重金属大多数容易在植物体内积累，并通过食物链危害人类的健康。。另一方面，由于蛋白质的半胱氨酸、甲硫氨酸和组氨酸残基对二价金属离子有很高的亲和力，因此细胞内过量的重金属可能干扰必需金属元素与蛋白的结合，造成蛋白变性或酶失活，干扰正常的代谢过程。
[0003]固定化金属亲和层析(IMAC)与质谱偶联是鉴定金属结合蛋白的重要技术。IMAC是利用蛋白中的一些氨基酸，如半胱氨酸、组氨酸和色氨酸等，能与固体柱(如琼脂糖-1DA)上吸附的金属阳离子(如Zn2+，Cu2+，Ni2+和Cd2+等)发生结合的特性，来分离具有该金属结合位点的蛋白质。但是在重金属污染环境中，植物细胞内蛋白质的金属结合位点可能被提前进入细胞内的金属离子占据，使蛋白质没有多余的金属结合位点与亲和层析柱上固定金属结合，从而导致金属结合蛋白不能被分离或分离不完全。更重要的是，绝大多数蛋白的金属结合位点存在于分子内部，因此自然状态下，我们很难通过IMAC方法分离到特异的金属结合蛋白，但是之前对金属结合蛋白的研究文献中均未对此加以考虑。
【发明内容】
[0004]本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法，利用琼脂糖-NTA (氮川三乙酸)来分离变性条件下的铜结合蛋白，大大提高了铜结合蛋白的获得效率，建立了一套适合于过量重金属处理条件下组织或细胞中金属蛋白质组的分离技术。
[0005]—种利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法，包括以下步骤:
(1)、取生物组织或细胞用液氮充分研磨后，加入蛋白提取液，混合均匀后，低温离心，获得变性的蛋白溶液；研磨后生物组织或细胞与蛋白提取液的固液比为:1:4 ;所述蛋白提取液的组成成份为:每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠，pH 7.8, 300mmol/L氯化钠，质量百分比为0.1-1%的Triton X-100, 8mol/L尿素，余量为水；
(2)、将购买的N1-NTA琼脂糖中Ni2+替换成Cu2+装入层析柱中；将上述步骤(I)所获得的变性的蛋白溶液以0.25ml/min流速注入Cu-NTA琼脂糖，37°C条件下孵育15_40min，使变性蛋白与之充分结合；然后低温条件下，以0.25ml/min流速缓慢注入洗脱液1，对蛋白进行复性，将非特异性的铜结合蛋白洗脱出来；然后再以0.5ml/min流速注入洗脱液2将特异性的铜结合蛋白分离出来；
所述洗脱液I组成成份为:每升洗脱液I中含50 mmol/L磷酸钠，300 mmol/L氯化钠，10-50 mmol/L余量为水；洗脱液I的pH值为6.5 ; 所述洗脱液2组成成份为:每升洗脱液2中含50 mmol/L磷酸钠，300 mmol/L氯化钠，40-100 mmol/L咪唑；洗脱液2的pH值为5.8。
[0006]步骤(I)中所述低温离心，其方法优选为，4°C低温下，15000g离心30min。
[0007]步骤(2)中所述将N1-NTA琼脂糖(GE Healthcare)中Ni替换成Cu，其方法为:将2ml的N1-NTA琼脂糖装入层析柱中，注入10倍体积的含有0.05mol/L EDTA和0.5mol/L氯化钠的溶液去除Ni'再用3倍体积的0.5mol/L氯化钠水溶液去除EDTA，随后I倍体积的0.2mol/L硫酸铜水溶液室温下放置30min后用平衡缓冲液，洗脱30 min，直到紫外检测基线稳定；流速均为0.5 ml/min。所述平衡缓冲液的组成成份为:每升平衡缓冲液中含有50 mmol/L磷酸钠，pH 7.8，300 mmol/L氯化钠，质量百分比为0.1_1%的TritonX-100，余量为水。
[0008]步骤(2)中所述将(I)中蛋白溶液和Cu-NTA琼脂糖37°C孵育30min，使变性蛋白与Cu-NTA琼脂糖充分结合。
[0009]步骤(2)所述加入洗脱液1，以0.25ml/min流速的洗脱，直到紫外检测基线达到稳定；所述加入洗脱液2，以0.5ml/min流速的洗脱，直到紫外检测基线达到稳定，收集特异性铜结合蛋白。
[0010]步骤(I)中所述蛋白提取液的组成成份为:所述蛋白提取液的组成成份为:每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠，pH 7.8, 300mmol/L氯化钠，质量百分比为0.2%的Triton X-100, 8mol/L 尿素，余量为水。
[0011]有益效果是:
本发明提供的利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法，程序简单，大大提高了铜结合蛋白的获得效率，建立了一套适合于过量重金属处理条件下生物组织或细胞中金属蛋白质组的分离技术。本发明中的变性条件能够使蛋白多肽链处于伸展状态，更利于与固定金属离子的亲和吸附作用，而在去除变性条件的蛋白质复性过程由于在磁珠表面进行，避免了变性蛋白的聚集沉淀，而且形成的配合物更稳定，保证分离到尽可能多的铜结合蛋白。
【附图说明】
[0012]图1是非特异性铜结合蛋白(I)和特异性铜结合蛋白(II)的紫外检测图；
图2是水稻铜结合蛋白的2-DE对照图谱；
图3是水稻铜结合蛋白的2-DE图谱；
图4鉴定到铜结合蛋白(GST)的质谱图；
图中标记:con为对照；cu为铜。
【具体实施方式】
[0013]—种利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法，包括以下步骤:
(1)、取生物组织或细胞用液氮充分研磨后，加入蛋白提取液，混合均匀后，低温离心，获得变性的蛋白溶液；研磨后生物组织或细胞与蛋白提取液的固液比为:1:4 ;所述蛋白提取液的组成成份为:每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠，pH 7.8, 300mmol/L氯化钠，质量百分比为0.1-1%的Triton X-100, 8mol/L尿素，余量为水；
(2)、将购买的N1-NTA琼脂糖(GEHealthcare)中Ni2+替换成Cu 2+装入层析柱中；将上述步骤(I)所获得的变性的蛋白溶液以0.25ml/min流速注入Cu-NTA琼脂糖，37°C条件下孵育15-40min，使变性蛋白与之充分结合；然后低温条件下，以0.25ml/min流速缓慢注入洗脱液1，对蛋白进行复性，将非特异性的铜结合蛋白洗脱出来；然后再以0.5ml/min流速注入洗脱液2将特异性的铜结合蛋白分离出来；
所述洗脱液I组成成份为:每升洗脱液I中含50 mmol/L磷酸钠，300 mmol/L氯化钠，10-50 mmol/L余量为水；洗脱液I的pH值为6.5 ;
所述洗脱液2组成成份为:每升洗脱液2中含50 mmol/L磷酸钠，300 mmol/L氯化钠，40-100 mmol/L咪唑；洗脱液2的pH值为5.8。
[0014]步骤(I)中所述低温离心，其方法优选为，4°C低温下，15000g离心30min。
[0015]步骤(2)中所述将N1-NTA琼脂糖(购买于GE Healthcare公司)中Ni2+替换成Cu2+，其方法为:将2ml的N1-NTA琼脂糖装入层析柱中，注入10倍体积的含有0.05mol/L EDTA和0.5mol/L氯化钠的溶液去除Ni'再用3倍体积的0.5mol/L氯化钠水溶液去除EDTA，随后I倍体积的0.2mol/L硫酸铜水溶液室温下放置30min后用平衡缓冲液，洗脱30 min，直到紫外检测基线稳定；流速均为0.5 ml/min。所述平衡缓冲液的组成成份为:每升平衡缓冲液中含有50 mmol/L磷酸钠，pH 7.8，300 mmol/L氯化钠，质量百分比为0.1-1% 的 Triton X-100，余量为水。
[0016]步骤(2)中所述将(I)中蛋白溶液和Cu-NTA琼脂糖37°C孵育30min，使变性蛋白与Cu-NTA琼脂糖充分结合。
[0017]步骤(2)所述加入洗脱液1，以0.25ml/min流速的洗脱，直到紫外检测基线达到稳定；所述加入洗脱液2，以0.5ml/min流速的洗脱，直到紫外检测基线达到稳定，收集特异性铜结合蛋白。
[0018]步骤(I)中所述蛋白提取液的组成成份为:所述蛋白提取液的组成成份为:每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠，pH 7.8, 300mmol/L氯化钠，质量百分比为0.2%的Triton X-100, 8mol/L 尿素，余量为水。
[0019]本发明中提到的Cu-NTA琼脂糖中Cu2+也可以替换为Ni 2+\Zn2+\Cd2+等其他二价金属离子，从而获得相应的金属结合蛋白。以下实施例用于解释说明本发明，并不对本发明的保护范围有任何形式的限定。
[0020]实施例1
一、植物蛋白的提取
用100 μ mo I L1硫酸铜处理的萌发的水稻种胚，铜处理5天后取新鲜的水稻种胚，用液氮充分研磨，然后加入4倍体积的蛋白提取液充分混匀后放在4°C下提取30 min，在4°C下、15，OOOXg离心30 min，收集上清。用修改的Bradford法(Ramagli，1999)对变性蛋白进行定量，以鸡卵清蛋白作为标准蛋白。所述蛋白提取液的组成成份为:每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠，pH 7.8，300mmol/L 氯化钠，质量百分比为0.1-1% 的 Triton X-100,8mol/L尿素，余量为水.二、Cu-NTA琼脂糖亲和层析过程
(I)装柱:将2 ml床体积的N1-NTA琼脂糖(GE Healthcare)沿管壁加入到玻璃管中，待胶沉淀后将活塞推到合适的位置。加入10倍体积的0.05mol/L EDTA和0.5mol/L氯化钠的混合溶液去除Ni'再用3倍体积的0.5mol/L氯化钠去除EDTA，然后用蒸馏水洗，流速为0.5 ml/min，直到紫外检测达到稳定基线。
[0021](2)结合Cu2+:加入I倍床体积的0.2 mo I/L硫酸铜溶液，室温下放置30 min,使Cu2+充分结合到填料上。用平衡缓冲液洗柱子30 min，流速为0.5 ml/min，紫外检测基线稳定。
[0022](3)孵育结合:将蛋白含量为25mg的蛋白溶液和Cu-NTA sepharose在37°C条件下孵育20min，使变性蛋白与固定Cu离子充分结合；随后用平衡缓冲液洗30 min，流速为0.5 ml/min。
[0023](4)复性及非特异性洗脱:用洗脱液I (洗脱液I的组成为:50 mmol L磷酸钠，pH 6.5，300 mmol/L氯化钠，20 mmol/L咪卩坐)洗脱，流速为0.25 ml/min，保证蛋白复性顺利进行，洗脱至30 min左右，紫外检测示数开始增加，开始采集图像，收集非特异洗脱峰。图像采集至48 min时，紫外检测基线已经达到稳定。
[0024](5)特异性洗脱:用洗脱液2 (洗脱液2的组成为:50 mmol/L磷酸钠，pH 5.8，300 mmol/L氯化钠1，60 mmol/L咪卩坐)进行特异性洗脱，流速为0.5 ml/min。10 min后开始出现特异性洗脱峰，开始收集样品，15 min后达到紫外检测基线，停止收集样品。图1为特异性和非特异性铜结合蛋白的紫外检测结果。
[0025]三、特异性铜结合蛋白的2-DE分析和质谱鉴定
将以上收集的特异性铜结合蛋白中加入4倍体积冰丙酮(含10%三氯乙酸)，在-20°C下沉淀过夜，然后用80%冰丙酮洗沉淀2~3遍，真空冻干后，加入裂解液充分溶解，裂解液的组成为:8 mol/L 尿素，4% CHAPS, 65 mmol/L DTT 和 0.2% (w/v)两性电解质，4°C下12，OOOXg离心15 min。随后用修改的Bradford法(Ramagli，1999)对变性蛋白进行定量。取1