分离缓冲液使得细胞的终浓度为IXIO7 个/ml〇
[0207] 3)B细胞的分选
[0208] 向管子中加入Iml的细胞，然后加入25y1步骤1)中的免疫磁珠；
[0209] 在4°C孵育20min，置于摇床上轻轻摇晃；
[0210] 把管子置于磁体2min;
[0211] 小心地弃掉上清；
[0212] 把管子从磁体中取出，向其中加入Iml分离缓冲液，吹打2-3次（或涡旋2_3s)，再 把该管子置于磁场中2min，小心地弃掉上清；
[0213] 重复上一步至少一次，清洗和磁珠连接的B细胞。
[0214]3、B细胞的活化反应
[0215] LPS刺激B细胞
[0216] 准备单个B细胞的悬浮液，用RPMI1640完全培养基培养调整B细胞密度为IXIO6 个/ml，加入到96孔板中，加入lOug/mlLPS，37°C培养72-96h。
[0217] 4、免疫印迹分析
[0218] 三、结果
[0219] 实验结果如图5所示，纯化的Ebi3-Flag/P19_His蛋白具有生物学活性，它能有效 地刺激B细胞中STAT1、STAT3的磷酸化。
[0220] 实施例5LPS活化的B细胞高表达P19/Ebi3
[0221] 一、材料
[0222] 抗P19抗体购自eBioscience公司（货号50-7023-82)、抗P28抗体购自 eBioscience公司（货号12-7285-80)、抗P35抗体购自eBioscience公司（货号 50-7352-80)、抗P40 抗体购自eBioscience公司（货号 12-7123-81)、抗Ebi3 抗体购自R&D 公司（货号IC18341C)
[0223] 二、方法
[0224] I、LPS刺激B细胞
[0225] 2、阻断Fe受体：（用于消除非特异性的结合染色）
[0226]使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32)，按照Iyg/106细胞的用量，在染色 缓冲液中4°C孵育15min，PBS清洗后，直接进行下一步染色。
[0227] 3、细胞内因子染色及检测
[0228] 1)固定：加入ICFix/PermBufferlOOy1，混匀，室温孵育20min。
[0229]2)用IXPermWashBufferIml洗涤 1 次（2000rpm，IOmin)，倾倒后滤纸吸干管口 液体。
[0230] 3)破膜：加入IXPermWashBuffer1ml，混勾，4°C孵育45min。
[0231]4)离心（2000rpm，IOmin)，倾倒后滤纸吸干管口液体。
[0232] 5)加入细胞因子抗体，4°C孵育45min。
[0233] 6)用IXPermWashBufferIml洗涤1次，倾倒后，加入300yIPBS重悬细胞。
[0234] 7)上机检测。
[0235] 三、结果
[0236] 实验结果如图6所示，LPS活化的B细胞表达少量P28,P35,P40,而高表达P19/ Ebi3〇
[0237] 实施例6LPS活化的B细胞能分泌高水平的P19/Ebi3
[0238] 一、材料
[0239] 购自SantaCruzBiotech公司的抗Ebi3抗体（货号sc-32869)、抗P40抗体（货号 sc-7926)、抗P19抗体（货号sc-50303)、抗P28抗体（货号sc-27490)、抗P35抗体（货号 sc-9350)
[0240] 二、方法
[0241] 1、B细胞的活化
[0242] 2、ELISA实验
[0243]1)包被过程（注意设置空白对照，阴性对照）
[0244] 将所用抗原用包被稀释液稀释到适10yg/ml，每孔抗原加入100y1，置于37°C， 4h或4°C过夜；可包被BSA溶液或只加包被液作为空白对照。
[0245] 2)封闭酶标反应孔
[0246] 弃去孔内液体，每孔加入200y1封闭液，37°C湿盒封闭6h或4°C过夜，结束后用洗 涤液洗涤3-5次，并于吸水纸上轻轻拍干。
[0247]3)加入待检测样品
[0248] 加一定稀释的待检样品100y1于上述已包被的反应孔中，加PBST作为空白对照。 置37°C，孵育45min。然后洗涤3-5次，并于吸水纸上轻轻拍干。
[0249] 4)加入酶标抗体
[0250] 于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度：1:1000以上稀 释）100y1。37°C孵育45min，洗涤3次，并于吸水纸上轻轻拍干。
[0251] 5)加入底物液（现用现配）
[0252] 于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100y1，37°C，10~30min。
[0253]6)终止反应
[0254] 于各反应孔中加入2M硫酸50y1，于20min内测定实验结果。
[0255] 7)结果判断
[0256] 用Bio-Rad酶标仪于450nm以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性 对照OD值的2. 1倍，即为阳性（数值的大小依具体检测要求而定）。
[0257] 3、双抗夹心ELISA实验
[0258] 参照上述实验步骤。
[0259] 三、结果
[0260] 实验结果如图7所示，（左图）LPS活化的B细胞分泌少量P28,P35,P40,而分泌 高水平的P19、Ebi3;(右图）LPS活化的B细胞分泌少量IL-23,IL-27,而分泌高水平P19/ Ebi3〇
[0261] 实施例7向浆细胞分化（GL7+)的B细胞高表达P19/Ebi3
[0262] 一、方法
[0263] 实验操作参照实施例5的方法。
[0264] 二、结果
[0265] 实验结果如图8所示，从图中我们可以看出向浆细胞分化（GL7+)的B细胞高表达 P19/Ebi3〇
[0266] 实施例8系统性红斑狼疮（SLE)小鼠模型中向浆细胞分化（GL7+)的B细胞和浆 细胞（CD138+)细胞高表达P19/Ebi3
[0267] -、材料
[0268] 系统性红斑狼疮自发性模式小鼠：雌性MRL/MpJ/lpr/lpr(MRL/lpr)小鼠购自南 京模式生物研究所;MRL/MpJ/+/+(MRL/++)小鼠购自医科院基础医学研究所。
[0269] 二、方法
[0270] 向浆细胞分化（GL7+)的B细胞、浆细胞（CD138+)的获取及计数
[0271] 1、系统性红斑狼疮小鼠脾脏细胞的获取
[0272]1)取小鼠脾脏，放入盛有5mlHanks液的培养皿中。
[0273] 2)轻轻研压脾脏（顺同一方向），用吸管吸取脾细胞悬液，放入试管中。
[0274] 3)镜下细胞计数：40倍镜头，观察脾细胞。
[0275] 2、淋巴细胞的分选
[0276] 1)稀释脾细胞（脾细胞：稀释液=1: 2)。
[0277] 2)在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll:稀释 脾细胞=1:2)，20°C，1500rpm，离心 30min。
[0278]3)沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。
[0279] 4)加足量稀释液充分洗涤，1800rpm离心lOmin，弃上清。
[0280] 5)重复洗涤一次，1400rpm离心lOmin，弃上清。
[0281]6)适量的培养基重悬细胞，即是小鼠脾淋巴细胞悬液。
[0282] 3、淋巴细胞的计数
[0283] 稀释细胞，计数板放到显微镜下进行计数。
[0284] 4、细胞流式技术分析GL7+和CD138 +细胞
[0285] 1)在每个流式检测管中加入适量的预稀释好的一抗（荧光标记抗B220、GL7、 CD138抗体）；在空白管或同型对照管中加入与抗体相同量的对照试剂。然后各管避光冰浴 或在4°C冰箱中孵育30min。
[0286] 2)加入至少2mlCellStainingBuffer，然后350g离心5min后弃去上清液；重复 洗涤两次。
[0287] 3)用0?5mlCellStainingBuffer重悬细胞，冰上孵育 3_5min。
[0288] 5、上机检测并分析结果。
[0289]二、结果
[0290] 实验结果如图9所示，系统性红斑狼疮（SLE)小鼠模型中向浆细胞分化（GL7+)的 B细胞和浆细胞（CD138+)细胞及高表达P19/Ebi3的向浆细胞分化（GL7+)的B细胞和浆细 胞（⑶138+)细胞数目显著升高。
[0291] 实施例9抗P19/Ebi3多克隆抗体制备与鉴定
[0292] 一、方法
[0293]l、P19/Ebi3的制备与纯化
[0294] 实验操作参照实施例3。
[0295] 2、多克隆抗体的制备
[0296] 1)免疫动物的选择：10只7-9周龄健康雄性Balb/c小鼠。
[0297] 2)免疫原：使用经镍柱纯化的P19/Ebi3复合物。每次免疫100-200yg。
[0298] 3)待小鼠在新环境中培养3~4天后，取0.Iml尾静脉血作为阴性对照。
[0299] 4)小鼠的免疫
[0300] 用纯化的P19/Ebi3复合物与完全弗氏佐剂等体积混合后采用背部多点注射法免 疫小鼠，每次注射100y1，2周后用所述的复合物与不完全弗氏佐剂等