芦苇内生真菌及其提取物的制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，主要涉及一种从银川野生芦苇根系中分离得到的一 株内生真菌N〇51及其醇提取物的制备方法和用途，主要涉及其醇提取物的制备方法及其 对水稻稻瘟病的诱导抗病作用。
【背景技术】
[0002] 作为水稻主要病害之一的稻瘟病，流行年份造成水稻严重减产。目前稻瘟病的防 治措施主要包括抗病品种选育、药剂防治和栽培管理。当病害突发或己经形成时，速效的化 学防治仍然是最为有效的防治手段。但农药对环境污染大、费用高，长期使用会导致稻瘟病 菌产生抗药性。因此，寻求新的、有效的防治稻瘟病的方法或途径有着非同寻常的意义。近 年来，随着植物诱导抗病性的迅速发展，用其防治稻瘟病取得了显著的效果，对稻瘟病诱导 剂的研究也随之增多和深入。诱抗剂通过激活水稻潜在的防御机制，诱导潜在抗性基因的 表达，以此来达到防御稻瘟病的目的。诱抗剂将成为防治稻瘟病的一种重要形式。
【发明内容】
[0003] 本发明针对上述现有技术中存在的问题，以水稻稻瘟病病菌为靶标，从银川野生 芦苇根系中分离得到的一株内生真菌N〇51，其醇提取物对稻瘟病具有诱导抗病效果。并对 内生真菌N〇51进行了种属鉴定和醇提取物诱导抗病效果的系统研究，旨在为新型微生物 源农药的研制和开发提供优良的出发菌株。
[0004] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0005] 从银川野生芦苇根系中分离纯化得到内生真菌N〇51，该内生真菌分类名称为：镰 孢菌属（Fusariumsp.)，其保藏编号为CGMCCNO. 10118,保藏日期为2014. 12. 11，保藏单位 名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号。
[0006] 利用CTAB法提取内生真菌基因组DNA，利用通用引物ITS4与ITS5进行基因的PCR 扩增和测序；所述的内生真菌引物ITS4与ITS5扩增DNA序列如下：
[0008] 所述的芦苇内生真菌提取物的制备方法包括如下步骤：从银川野生芦苇根系中分 离纯化得到内生真菌N〇51，将该内生真菌在固体PDA培养基上培养后，转入液体PDA培养基 中；培养6d取出，抽提菌丝体后加入与菌丝体等倍体积的20wt%乙醇，浸提24h，过滤，滤液 保存，即得到内生真菌代谢产物制备液。
[0009]所述的液体PDA培养基培养为，将活化的内生真菌菌种接种于装有IOmLPDA培养 基的小三角瓶中，置于28°C、200r? min1的摇床培养。
[0010] 所述内生真菌的醇提取物具有非常高的活性，微量使用后，对水稻的稻瘟病具有 较强的诱导抗病效果。
[0011] 本发明具有的优点和积极效果是：
[0012] 1.内生真菌N〇51的醇提取物作为新型的水稻抗病诱导剂具有高效、无毒、广谱的 特点，可以最大程度地降低农药的使用，减轻农药的环境污染。
[0013] 2.内生真菌N〇51的醇提取物作为新型水稻抗病诱导剂是一种具有超高活性的植 物内生菌的发酵产物，使用微量即能达到诱导抗病效果。
【具体实施方式】
[0014] 从银川野生芦苇根系中分离纯化得到内生真菌N〇51，该内生真菌分类名称为：镰 孢菌属（Fusariumsp.)，其保藏编号为CGMCCNO. 10118,保藏日期为2014. 12. 11，保藏单位 名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号。
[0015] 利用CTAB法提取内生真菌基因组DNA，利用通用引物ITS4与ITS5进行基因的PCR 扩增和测序；所述的内生真菌引物ITS4与ITS5扩增DNA序列如下：
[0017] 实施例1
[0018] 1.内生真菌代谢产物的制备
[0019] 将活化的内生真菌菌种接种于装有IOmLPDA培养基的小三角瓶中，置于28°C、 200r?min-1的摇床培养6d取出，抽提菌丝体后加入与菌丝体等倍体积的20wt%乙醇，浸 提24h，过滤，滤液保存，即得到内生真菌代谢产物制备液。
[0020] 稻瘟病菌孢子悬液制备
[0021] (1)病菌预备培养：将稻瘟病菌分别移植于燕麦片番茄汁琼脂培养基上，为生长 迅速可多移接几点；25~27°C条件下培养5~7d，备用。
[0022] (2)菌丝培养：用无菌水轻轻洗下菌丝和分生孢子，制成菌悬液，将悬浮液均匀涂 于另一新的平板培养基上，每皿约〇.5mL，超净工作台中吹干；置于25°C培养箱中培养约 35~40h，至培养基表面长出一层稀疏的气生菌丝体。
[0023] (3)产孢培养：向菌落上加500ul无菌水，用棉签轻轻擦去表面的气生菌丝，并用 水将培养基表面的菌丝和分生孢子清洗干净，待培养基表面晾干后罩上2层纱布，用皮筋 绑好，于25°C光照条件下培养至有大量分生孢子产生（约2~3d)。
[0024] (4)菌悬液制备：用清水从培养基上洗下分生孢子，过滤，弃上清，沉淀下的分生 孢子用体积分数〇. 2%的Tween20水溶液悬浮，血球计数板计数，孢子悬浮液浓度调至 2XIO5个孢子/ml(15X10镜下约20~30个孢子），供接种应用。
[0025] 2?稻痕病菌孢子接种
[0026] 水稻盆栽，待水稻长到3叶1心时，将终浓度50ng/mL的内生菌代谢产物制备液， 喷施于水稻叶片表面。3天后接种稻瘟病菌孢子悬浮液。观察水稻叶片稻瘟病发病情况。 病情严重程度按统一标准进行评定，见表1。发病情况用病情指数与诱导效果表示。
[0029] 4.内生真菌的序列分析
[0030] 利用CTAB法提取内生真菌基因组DNA，利用通用引物ITS4与ITS5进行基因的PCR 扩增和测序。反应体系为50yL。反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火 30s，72°C延伸lmin，共30个循环，72°C延伸5min。PCR产物进行纯化并测序。基于BLAST 搜索，选取与供试研究菌株序列最接近的种或最靠近的进化分支代表亲缘关系较近的菌株 序列进行比对，利用DNAStar软件构建进化树。
[0031] 实施例2
[0032] 1、内生真菌代谢产物的制备
[0033] 将活化的内生真菌菌种接种于装有IOmLPDA培养基的小三角瓶中，置于28°C、 200r?min-1的摇床培养6d取出，抽提菌丝体后加入与菌丝体等倍体积的20wt%乙醇，浸 提24h，过滤，滤液保存，即得到内生真菌代谢产物制备液。
[0034] 2、稻瘟病菌培养
[0035] 将稻瘟病菌分别移植于PDA固体培养基上，为生长迅速可多移接几点；25~27°C 条件下培养5~7d，备用。
[0036] 3.稻瘟病菌接种
[0037] 水稻盆栽，待水稻长到3叶1心时，将终浓度50ng/mL的内生菌代谢产物制备液， 喷施于水稻叶片表面。
[0038] 48h后，将几层吸水纸剪成培养皿底合适大小的圆片，平铺于塑料培养皿内，加水 浸湿。取尚未完全展开的第5叶中部5cm左右的叶段，置于保湿的培养皿内，每皿放4个叶 段，然后将稻瘟病菌置于叶片上，用针头轻轻扎一小孔。
[0039] 接种叶段的培养皿在28°C完全黑暗、100%相对湿度条件下保湿30h左右。然后在 28 °C全光照条件下培养，随时观察病斑的抗感反应型。
[0040] 病情严重程度按统一标准进行评定（见表2)。发病情况用病情指数与诱导效果表 不。
[0041 ]
[0043] 4.内生真菌的序列分析
[0044] 利用CTAB法提取内生真菌基因组DNA，利用通用引物ITS4与ITS5进行基因的PCR 扩增和测序。反应体系为50yL。反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火 30s，72°C延伸lmin，共30个循环，72°C延伸5min。PCR产物进行纯化并测序。基于BLAST 搜索，选取与供试研究菌株序列最接近的种或最靠近的进化分支代表亲缘关系较近的菌株 序列进行比对，利用DNAStar软件构建进化树。
[0045] 表1水稻稻瘟病病情严重情况评定标准
【主权项】
1. 芦苇内生真菌，其特征在于该内生真菌分类名称为：镰孢菌属（Fusarium sp.)，其 保藏编号为CGMCC NO. 10118,保藏日期为2014. 12. 11，保藏单位名称：中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2. 根据权利要求1所述的芦苇内生真菌，其特征在于所述的内生真菌引物ITS4与 ITS5扩增DNA序列如下： CCCTCGGGCATTCCGACCTGATTCGAGGTCACTTCAGAAGAGTTGGGTGTTTTACGGCGTGGCCGCGCCGC TCTCCAGTCGCGAGGTGTTAGCTACTACGCGATGGAAGCTGCGGCGGGACCGCCACTGTATTTGGGGGACGGCGTG TGCCCACGGGGGGCTCCGCCGATCCCCAACGCCAGGCCCGGGGGCCTGAGGGTTGTAATGACGCTCGAACAGGCATG CCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTA TCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAATTTATTTGCTTGTTT TACTCAGAAGAAACATTATAGAAACAGAGTTAGGGGTCCTCTGGCGGGGGCGGCCCGTTTCACGGGGCCGTCTGTTC CCGCCGAAGCAACGTTTAGGTATGTTCACAGGGTTGATGAGTTGAATAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCAC CAACGGAGACCTTGTTACGATTTTTACTTACA。3. 根据权利要求1所述的芦苇内生真菌提取物的制备方法，其特征在于包括如下步 骤：从银川野生芦苇根系中分离纯化得到内生真菌N 〇51，将该内生真菌固体PDA培养基 上培养后，转入液体PDA培养基中；培养6d取出，抽提菌丝体后加入与菌丝体等倍体积的 20wt %乙醇，浸提24h，过滤，滤液保存，即得到内生真菌代谢产物制备液。4. 根据权利要求3所述的芦苇内生真菌提取物的制备方法，其特征在于所述的液体 PDA培养基培养为，将活化的内生真菌菌种接种于装有IOmLPDA培养基的小三角瓶中，置于 28°C、200r ? min 1的摇床培养。5. 根据权利要求1所述的芦苇内生真菌的提取物在水稻抗病诱导剂中的应用。
【专利摘要】本发明涉及微生物技术领域，主要是涉及一种从银川野生芦苇根系中分离得到的一株内生真菌No51及人工培养条件下的菌丝醇提取物对水稻稻瘟病的诱导抗病作用。该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该内生真菌分类名称为：镰孢菌属<i>Fusarium</i><i>？sp.</i>。该发明的目的是通过相关产品的应用，对水稻的稻瘟病产生较强的诱导抗病效果，以此作为一种新型的水稻抗病诱导剂。CGMCC NO.1011820141211
【IPC分类】C12R1/77, A01N63/04, A01P3/00, C12P1/02, C12N1/14
【公开号】CN105087386
【申请号】CN201510128499
【发明人】肖军, 陈珣, 王红, 肇莹, 龚娜, 杨涛, 杨镇, 李会
【申请人】辽宁省农业科学院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年3月23日