中更容易长出愈伤组织。
[0035](3)七步式的培养方法，本发明的实验过程包括侵染、预培养、共培养、叶片清洗、愈伤组织诱导培养、芽诱导培养、根诱导培养这七个步骤，在每一个步骤都有特定的方法和特定的培养基配方，根据蓝莓生长各个阶段的特点，研究出适合不同转基因阶段的培养基配方，比以前的转基因过程更加细化，更大程度提高了转基因的效率。
[0036]本实验的转基因转化效率达到10%，文献报道的蓝莓转基因效率一般都在1%以下，因此，我们的发明大幅地提高了蓝莓转基因效率。
[0037](4)中间用两种抗生素的液体来冲洗共培养后的叶片，减小后期农杆菌污染的可能性。
[0038](5)使用gataway载体系统，携带能够容易检测的Egfp基因，似的后期的检测工作量极大的减小，并且缩短培养过程。
[0039](6)菌液浓度和侵染时间的优化是本发明中最重要的以部分，不同于传统的蓝莓转基因方法中的菌液浓度高时间短的侵染方法，本发明中使用低浓度菌液，长时间侵染，经过多次试验，如图1和图2的数据能够证明，低浓度长时间侵染能够大幅度提高转化效率，而且培养后期不容易产生农杆菌污染。而且采用低浓度菌液长时间侵染能够显著提高Egfp基因表达率，提高转化效率。
[0040]
上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，其特征在于，包括以下步骤: I)菌种活化:将含质粒PK7WG2D农杆菌AGLO在含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB固体培养基上划线，28 °C培养2天；挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50mL含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB液体培养基中，28 V, 220 rpm在摇床中振荡培养至0D600值0.4 ;常温下，5000rmp离心8分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上清液去除，用100 mL改良WPM液体培养基重悬菌体，在摇床中振荡培养大约I小时测定OD600值为0.2?0.3之间； 2)植物材料准备:取蓝莓美登组培苗上幼嫩、平展的35?40天叶龄的叶片，从叶片中间横切一刀，将叶片切为两段； 3)预培养:将剪好的蓝莓叶片放置于培养基S2上预培养3天，这个过程能够使蓝莓叶片尽可能吸水，软化叶片； 4)侵染:预培养完成后将叶片放入悬浮的菌液中，在恒温摇床中150转每分钟的速度轻微摇匀，浸染40分钟，过程中一直摇动，增加菌液和叶片的接触面积，侵染完成后倒出菌液，将叶片在无菌滤纸上吸干表面的菌液； 5)共培养:侵染后的叶片接种在蓝莓共培养基S2中，25°C培养箱中黑暗培养3天； 6)洗叶片:因此共培养完成后将叶片放置于含有300mg/L羧苄青霉素和的300mg/L头孢霉素的无菌水中清洗叶片10分钟，清洗完成后用无菌滤纸吸干水分； 7)愈伤诱导:清洗完成的蓝莓叶片，接种在蓝莓筛选培养基S3上，使伤口与培养基充分接触，在培养室中25±2 °C，先暗培养21天，然后光照培养，培养40天左右，蓝莓叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分愈伤有非常亮的绿光发出，这部分愈伤为抗性愈伤，要保留下，而一部分没有发光，这部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉，将发光的愈伤挑出，转入下一步的芽诱导培养基； 8)芽诱导:将诱导完成的愈伤组织接种在蓝莓芽诱导培养基S4上，培养室中光照培养，培养20天左右，遇上组织上会有小芽长出，继续培养，芽慢慢长成植株，叶片清晰可见，此时在体式荧光显微镜下进行观察，明显看出叶片有非常亮的绿光发出，而有一部分植株没有发光将发光的植株挑出，转入下一步的根诱导培养基； 9)根诱导培养:抗性植株长到大约2-3厘米高时，将抗性植株转入蓝莓生根筛选培养基S5上生根，获得完整的抗性苗，此时的抗性苗还不能完全确定是不是转基因苗，因此需要再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片，叶柄以及根都发亮绿光的可以确定为转基因植株。2.根据权利要求1所述的一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，其特征在于，所述培养基S2为改良的WPM培养基添加蔗糖30g/L，琼脂5.5 g/L、TDZ 6mg/L，pH5.4，高压灭菌，冷却至60°C左右分装平板备用；所述改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾500mg/L、(MM)2SO4硫酸铵 200 mg/L、MgSO 4.7H20 400 mg/L、KH2PO4 200mg/L、KI 1.1 mg/L、MnSO4.4H20四水合硫酸锰20 mg/L, ZnSO4.7H20七水合硫酸锌8 mg/L,氏803硼酸5 mg/L,乙二胺邻二轻基乙酸铁10 mg/L、CaCl2.2H20100 mg/L、肌醇100mg/L、烟酸I mg/L、维生素B1.5 mg/L、维生素 B61 mg/L、维生素 C2 mg/L。3.根据权利要求1所述的一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，其特征在于，所述培养基S3改良的WPM培养基添加葡萄糖15g/L、植物凝胶2.5 g/L、玉米素lmg/L、TDZ lmg/L、2，4-D 0.4mg/L，pH5.4，高压灭菌，冷却至60°C加入卡那霉素20mg/L，羧苄青霉素400mg/L分装培养瓶备用；所述改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾500 mg/L、(NH4) #04硫酸铵 200 mg/L、MgSO4.7H20 400 mg/L、KH2PO4 200mg/L、KI 1.1 mg/L、MnSO4.4H20 四水合硫酸锰20 mg/L, ZnSO4.7H20七水合硫酸锌8 mg/L,氏803硼酸5 mg/L,乙二胺邻二羟基乙酸铁 10 mg/L, CaCl2.2H20100 mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸 I mg/L、维生素 B1.5 mg/L、维生素 B61 mg/L、维生素 C2 mg/L。4.根据权利要求1所述的一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，其特征在于，所述诱导培养基S4改良的WPM培养基添加葡萄糖15g/L，植物凝胶2.5 g/L, ZT (玉米素)3mg/L，TDZ lmg/L，，ρΗ5.4，高压灭菌，冷却至60°C加入卡那霉素20mg/L，羧节青霉素350 mg/L分装培养瓶备用；所述改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾500 mg/L, (NH4) #04硫酸铵 200 mg/L、MgSO4.7H20 400 mg/L、KH2PO4 200mg/L、KI 1.1 mg/L、MnSO4.4H20 四水合硫酸锰20 mg/L, ZnSO4.7H20七水合硫酸锌8 mg/L,氏803硼酸5 mg/L,乙二胺邻二羟基乙酸铁 10 mg/L, CaCl2.2H20100 mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸 I mg/L、维生素 B10.5 mg/L、维生素B61 mg/L、维生素 C2 mg/L。5.根据权利要求1所述的一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，其特征在于，所述要生根筛选培养基S5改良的1/2WPM培养基添加蔗糖15g/L，植物凝胶2.5 g/L, IBA 0.6mg/L，pH5.8，高压灭菌，冷却至60°C加入羧苄青霉素300 mg/L分装培养瓶备用；所述改良的WPM 培养基配方含有 KNO3硝酸钾 500 mg/L, (NH4) 2S04硫酸铵 200 mg/L, MgSO 4.7H20 400mg/L、KH2PO4 200mg/L、KI 1.1 mg/L、MnSO4.4H20 四水合硫酸锰 20 mg/L, ZnSO4.7H20 七水合硫酸锌 8 mg/L、H3BOJMI 5 mg/L、乙二胺邻二羟基乙酸铁 10 mg/L, CaCl 2.2H20100 mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸 I mg/L、维生素 B10.5 mg/L、维生素 B61 mg/L、维生素 C2 mg/L。
【专利摘要】本发明公开了一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，包括以下步骤：1）菌种活化；2）植物材料准备；3）预培养；4）侵染；5）共培养；6）洗叶片；7）愈伤诱导；8）芽诱导；9）根诱导培养。本发明的方法提高了蓝莓转基因效率，转化率可达到10%以上。将菌液浓度降低，侵染时间加长，即避免农杆菌污染，又提高了侵染效率。侵染菌液中不添加任何的辅助侵染的药品药剂（传统方法中常添加乙酰丁香酮等辅助侵染的药剂，会对叶片造成伤害，降低叶片再生能力），减小对蓝莓叶片的伤害，提高叶片培养的成活率和再生率。使用携带强表达报告基因的载体，通过观察可直接筛选得到转基因植株，避免传统的检测中繁琐的工作。缩短了转基因的周期。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN105087637
【申请号】CN201510609558
【发明人】王媛花, 冯英娜, 史红林
【申请人】江苏农林职业技术学院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月22日