不同的构造利用。
[0182] 实施例
[0183] 本发明会参考以下实施例详细描述，但是本发明不限于此。
[0184] [实施例1]使用无细胞合成系统合成GlyOX并纯化GlyOX
[0185] 使用源自枯草芽孢杆菌168菌株的GlyOX的野生型基因或作为模板以制备具有引 入的目的突变的构建体的线性DNA的目的突变体基因通过2步PCR法将组氨酸标签和TEV 蛋白酶识别序列与N端侧融合。使用此DNA作为模板在源自大肠杆菌的无细胞合成反应系 统中合成蛋白质。用对Ni Sepharose High Performance(GE Healthcare Japan)的组氨 酸标签亲和力纯化上清液级份以产生洗脱级份，所述上清液级份在离心通过使用ImL反应 规模将透析法进行6小时合成的产物后获得。随后，通过SDS-PAGE和使用SYPRO ORANGE 蛋白质凝胶染剂（Life Technologies Japan Ltd.)染色鉴定可认为目的酶的蛋白质的存 在。通过Bradford法量化蛋白质，随后进行评估。对于野生型酶，以与上文相同的方式实 施线性DNA的制备、无细胞合成、和酶的纯化和分析。使用下述缓冲液进行纯化。
[0186] 结合缓冲液：750mM NaCl，20mM NaPi，pH 8. 0
[0187]清洗缓冲液：750mM NaCl，20mM NaPi，pH 8.0
[0188] 回收和测量缓冲液：300mM NaCl，50mM NaPi，34mM EDTA，pH 7. 0,10% D20,0. 01% NaN3
[0189] 在表示具有多个引入的突变的突变体GlyOX时，每个引入的突变使用斜线区分并 且连续描述。例如，突变体T42A/C245S表示具有T42A和C245S的两种突变的突变体GlyOX。 WT表示是野生型。
[0190] [实施例2]活性的测量
[0191] 通过下述规程评估实施例1中合成的野生型GlyOX和突变体GlyOX的活性。首先， 制备下述反应溶液A和B。
[0192] 反应溶液A :4mM酚，IOOmM磷酸钾，pH 8.0
[0193] 反应溶液B :50mM 4-氨基安体比林，500U/mL过氧化物酶
[0194] 随后，使用96孔微量板，混合49 y L反应溶液A，I y L反应溶液B，10 y L 2. 5mM Gly或IOOmM Gly，20yL超纯水，和20yL 0. 5mg/mL GlyOX以制备溶液，并且使用微板读板 仪（SpectraMax M2e, Molecular Device Japan)测量于 25°C在 3 分钟后溶液的 500nm波长 的吸光度的变化。每种突变体GlyOX的活性在表7和8中以相对于野生型GlyOX的活性的 比率显示。在实验针对相同样品进行三次时，从均值数值计算每个数值。表7和8显示了 在制备线性DNA时分别使用野生型基因和目的突变体基因作为模板合成的蛋白质的结果。
[0195] 表7:相对于野生型，每种突变体GlyOX的相对活性
[0197] 表8:相对于野生型的每种突变体GlyOX的相对活性
[0198]
[0200] [实施例3]稳定性的评估
[0201] 通过下述规程评估实施例1中合成的野生型酶和突变体酶的稳定性。将0. 5mg/mL 617(?在微管中分配，并且于4°(：，40°(：，50°(：和60°(：温育1小时。随后，在与实施例2中相 同的条件下使每种酶溶液起反应，只是添加IOOmM Gly底物溶液。从开始反应后10分钟的 吸光度变化测定活性。通过以相对于在4°C温育的酶溶液的活性的比率获得剩余活性评估 稳定性。表9和10中显示了结果。从对相同样品将实验进行两次时的均值数值计算表9 中的具有突变L301的GlyOX的每个数值。从对相同样品将实验进行三次时的均值数值计 算除上文描述的那些GlyOX外的GlyOX的每个数值。表9和10显示了在制备线性DNA时 分别使用野生型基因和目的突变体基因作为模板合成的蛋白质的结果。
[0202] 表9 :在加热1小时后野生型和每种突变体GlyOX的剩余活性。
[0203]
[0206] [实施例4]使用大肠杆菌的用于GlyOX的表达系统和GlyOX的纯化
[0207] 使用大肠杆菌构建用于GlyOX的重组表达系统。首先，构建用于重组表达的质粒。 通过使用 DNA 引物 I (TAATTCCATGGCTAAAAGGCATTATGAAGCAGTGGTGAITG: SEQ ID NO: 3)和 DNA 引物 2 (TAATACTCGAGTATCTGAACCGCCTCCTTGCGATC: SEQ ID NO: 4)的标准 PCR 方法扩增目的 基因。随后，用限制酶 NcoI (Takara Bio Inc.)和 XhoI (Takara Bio Inc.)消化 PCR 产物 和pET-28a(Merck KGaA)。将经消化的PCR产物和pET-28a用碱性磷酸酶（大肠杆菌C75) (Takara Bio Inc.)进行脱磷酸化。随后，使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen)实施去 蛋白质化（deproteination)和不必要消化片段的除去。使用Ligation High Ver. 2 (Toyobo Co.，Ltd.)连接这两种所得的产物。使用标准方法用连接产物转化大肠杆菌DH5 a菌株以 获得转化体。从所得的DH5 a转化体提取质粒，并且使用DNA序列的标准分析方法鉴定目 的基因对质粒的插入。在下文中，具有插入目的基因的此质粒称为pET-28a-GlyOX，并且用 pET28a-GlyOX 转化的 BL21 (DE3)转化体称为 pET28a-GlyOX-BL21 (DE3)。
[0208] 如下制备GlyOX。首先，来自其甘油储液的转化体pET28a-GlyOX_BL21(DE3)接种 至含有25 y g/mL卡那霉素的LB板，并且于37°C静态培养过夜。随后，将50mL含有25 y g/ mL卡那霉素的LB培养基置于具有挡板的250mL体积烧瓶中，对其接种LB板上的单一菌落， 并且于37°C在旋转摇动的情况下培养培养基中的菌落过夜。然后，将2L含有25 y g/mL卡那 霉素的LB培养基置于具有挡板的5L体积烧瓶中，将培养过夜的上述培养基完全添加至烧 瓶，并且在OD 66。的数值达到0. 5至0. 6时添加终浓度0. 5mM的IPTG。于30°C在旋转摇动的 情况中继续培养过夜，然后收集微生物细胞，用盐水清洗，在破坏缓冲液（20mM Tris-HCl， 0. 02 y M黄素腺嘌呤二核苷酸，pH 8.0)中悬浮，并于180W使用超声破坏装置（201M，从 Kubota Corporation供应）处理20分钟。以12, 000 Xg将经破坏的微生物细胞的此溶液离 心30分钟，并收集上清液。将上清液添加至用清洗缓冲液（50mM HEPES，500mM NaCl，20mM 味挫，0.02 11]\1黄素腺噪吟二核昔酸，。117.5)平衡的附36。]1&1'〇86 6?&8七？1〇￥(81_^^116(1 from GE Healthcare Japan)，然后，于室温通过倒置温和混合5分钟。随后，使用Econo-Pac 柱（从Bio-Rad Laboratories Inc?供应）通过自由降落除去溶液。在用清洗缓冲液清洗 后，用洗脱缓冲液（50mM HEPES，500mM NaCl，500mM咪唑，0.02yM黄素腺嘌呤二核苷酸，pH 7. 5)洗脱作为目的蛋白的GlyOX。在GlyOX溶液中，通过超滤用储液缓冲液（50mM磷酸钾， 0. 02 y M黄素腺嘌呤二核苷酸，pH 8. 0)更换溶剂，并将浓度调节至0. 5mg/mL。
[0209][实施例5]使用大肠杆菌制备突变体T42A/C245S/L301V
[0210] 如下制备突变体T42A/C245S/L301V。使用QuikChange Lightning定点诱变试剂 盒（从Agilent Technologies供应）并使用pET28a_Gly0X作为模板依照产品所附的方案 将突变引入GlyOX基因中。使用已经具有突变的质粒作为模板通过添加另一种突变引入多 种突变。使用已经具有突变的此质粒通过根据实施例4中描述的方法实施重组表达、纯化 和溶剂替换获得突变体T42A/C245S/L301V。
[0211] [实施例6]使用大肠杆菌制备突变体
[0212] 如下制备目的突变体。使用QuikChange Lightning定点诱变试剂盒（从Agilent Technologies供应）并使用pET28a_Gly0X作为模板依照产品所附的方案将突变引入 GlyOX基因中。使用已经具有突变的质粒作为模板通过添加另一种突变引入多种突变。使 用已经具有突变的此质粒通过根据下文描述的方法实施重组表达、纯化和溶剂替换获得目 的突变体。
[0213] 如下制备GlyOX。首先，来自其甘油储液的转化体pET28a-Gly0X_BL21(DE3)接种 至含有25 y g/mL卡那霉素的LB板，并且于37°C静态培养过夜。随后，将50mL含有25 y g/ mL卡那霉素的LB培养基置于具有挡板的250mL体积烧瓶中，对其接种LB板上的单一菌落， 并且于37°C在旋转摇动的情况下培养培养基中的菌落过夜。然后，将IL含有25 iig/mL卡那 霉素的LB培养基置于具有挡板的5L体积烧瓶中，将IOmL培养过夜的上述培养基添加至烧 瓶，并且在OD 66。的数值达到0. 5至0. 6时添加终浓度0. 5mM的IPTG。于30°C在旋转摇动的 情况中继续培养过夜，然后收集微生物细胞，用盐水清洗，在破坏缓冲液（20mM Tris-HCl， 0. 02 y M黄素腺嘌呤二核苷酸，pH 8.0)中悬浮，并于180W使用超声破坏装置（201M，从 Kubota Corporation供应）处理20分钟。以12, 000 Xg将经破坏的微生物细胞的此溶液离 心30分钟，并收集上清液。将上清液添加至用清洗缓冲液（50mM HEPES，500mM NaCl，20mM 咪唑，0.02 y M黄素腺嘌呤二核苷酸，pH 7. 5)平衡的HisTRap FF Crude (从GE Healthcare Japan供应）。在用清洗缓冲液清洗后，用洗脱缓冲液（50mM HEPES，500mM NaCl，500mM咪 唑，0.02 y M黄素腺嘌呤二核苷酸，pH 7. 5)洗脱作为目的蛋白的GlyOX。在GlyOX溶液中， 通过超滤用储液缓冲液（50mM磷酸钾，0.02 y M黄素腺嘌呤二核苷酸，pH 8.0)更换溶剂，并 将浓度调节至〇. 5mg/mL。
[0214][实施例7]活性的测量
[0215] 对实施例6中合成的野生型酶和突变体GlyOX评估活性。具体地，在实施例2中 显示的组成中，用实施例6中制备的GlyOX溶液替换酶溶液。表11中显示了结果。
[0216] 表11:相对于野生型酶，每种突变体GlyOX的相对活性
[0219] *反应溶液中的Gly浓度
[0220] [实施例8]稳定性的评估
[0221] 对实施例6中合成的野生型酶和突变体GlyOX评估稳定性。具体地，在实施例3 中显示的组成中，用实施例6中制备的GlyOX溶液替换酶溶液。表12中显示了结果。
[0222] 表12 :在加热1小时后野生型和每种突变体GlyOX的剩余活性。
[0223]
[0224][实施例9]使用大肠杆菌制备突变体T42A/C245S/L301V/G304Q
[0225] 以与实施例5中相同的方式制备突变体T42A/C245S/L301V/G304Q。
[0226][实施例10]底物特异性的评估
[0227]对野生型酶、突变体 T42A/C245S/L301V 和突变体 T42A/C245S/L301V/G304Q 评估 底物特异性。具体地，在实施例2中显示的组成中，用实施例4、5或9中制备的GlyOX溶液 替换酶溶液。作为底物，使用（I) ImM Gly，（2)含有各ImM的20种标准氨基酸，和胱氨酸，牛 磺酸，瓜氨酸，鸟氨酸和a-氨基丁酸的混合溶液，或（3)通过从（2) 25种氨基酸的混合溶 液扣除Gly获得的溶液替换Gly溶液。使用这些溶液，测量酶促活性以进行