将重悬液转移到一个新的50ml离心管中，加入Buffer B至40ml ;然后4°C，100g离心5min，收集上清；加入DNase I (终浓度为40 μ g/ml)，放置l-2h ;再加入ImL 0.5mol/L EDTA, pH 8.0,混匀后静置1min,终止反应；4°C，12000g离心20min，弃掉上清(若需要得到粗制线粒体沉淀，用2ml Buffer B重悬)；
[0053](5)提取线粒体DNA:
[0054]向沉淀中加入2ml溶液W1，使用移液器悬浮沉淀，加入250 μ I溶液W2，温和颠倒6-8次，加入350 μ I溶液W3，温和颠倒离心管，充分混匀溶液，12000g离心lOmin。吸取上清放入吸附柱(带有核酸硅胶膜的硅胶膜离心吸附柱)中，12000g离心30sec，倒掉收集管中的废液；将吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入600 μ I的漂洗液WT，12000g离心30sec，倒掉收集管中的废液；再次将吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入600 μ I的漂洗液WT，12000g离心30sec，倒掉收集管中的废液；将吸附柱放入收集管中，12000g离心2min，倒掉收集管中的废液；将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位滴加50 μ I洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000g离心2min，将溶液收集到离心管中。将最终提取的线粒体DNA放于-20°C保存。
[0055](6)按照上述方法，共提取5个萝卜样品的线粒体DNA，凝胶电泳检测线粒体DNA的质量。如图1所示，5个样品的线粒体DNA在>2kb处扩增出完整、清晰、明亮、无拖尾的条带，表明该方法提取的线粒体DNA基因组完整、浓度高、几乎无降解。
[0056]进一步地分别利用本发明中所述方法和传统方法(普通差速离心)提取5个萝卜样品的线粒体DNA，作为PCR模板，利用一对萝卜特异引物，分别对10个样品进行PCR扩增，凝胶电泳结果如图2所示。如图2所示，本发明所述提取方法得到的线粒体DNA作为模版，在500bp处的扩增条带均为清晰、明亮的目标条带；传统方法提取的线粒体DNA作为模板，并未在500bp处得到目标条带。
[0057]综上，采用该种提取线粒体的方法，每Ig组织提取到0.2 μ g mtDNA,总用时为3_4h，提取的线粒体DNA纯度高、质量好，完全满足PCR扩增、定量和定性分析、测序等分子生物学实验的要求。
[0058]比较实施例1:
[0059]步骤⑶中Buffer A不加1mM三甲基甘氨酸，PH值变低，最终产率由每克样品得到0.2 μ g线粒体DNA变为每克样品得到0.1 μ g线粒体DNA。
[0060]比较实施例2:
[0061]步骤(3)中Buffer A加入0.1% β -巯基乙醇，产率和质量无明显变化。
[0062]比较实施例3:
[0063]步骤(3)中Buffer A不加半胱氨酸，产率降低，线粒体DNA降解明显。
[0064]比较实施例4:
[0065]步骤(3)中研磨后PH若为7.0以下，产率降低。
[0066]比较实施例5:
[0067]步骤(4)中Buffer A、B不加0.1 % BSA,产率降低。
[0068]比较实施例6:
[0069]步骤⑷中离心力100g改为2000g，产率降低。
[0070]比较实施例7:
[0071]步骤(4)中的离心力12000g改为20000g，对离心机的要求提高，但产率和质量无明显变化。
[0072]比较实施例8:
[0073]步骤⑷中用2ml Buffer B重悬得到粗制线粒体后，加入缓冲液C 5_10ml，缓冲液 C 配方为:鹿糖 0.6mol/L，Tris-Cl 10mmol/L, EDTA 20mmol/L,pH = 7.2，实验步骤增多，但产率和质量无明显变化。
[0074]比较实施例9:
[0075]进一步地，步骤(4)中加入缓冲液C后，4°C，1000g离心5min，收集上清；4°C，12000g离心20min，实验步骤增多，但产率和质量无明显变化。
[0076]比较实施例10:
[0077]步骤(5)改为向沉淀中加入2ml预热CTAB溶液，65°C裂解lh，12000g离心lOmin，吸取上清液；加入等体积的苯酚:氯仿，混合摇匀，12000g，离心lOmin，吸取上清；加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，混合摇匀，12000g，离心lOmin，吸取上清；加入2/3体积的预冷异丙醇，冰浴30min ;12000g，离心lmin，用70%酒精洗涤沉淀数次；将mtDNA风干，加入30u I TE溶解mtDNA，_20°C保存，备用，产率和质量并无明显变化，但处理时间由30min变为4_5h0
【主权项】
1.一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，具体包括下述步骤: (1)溶液配制 Buffer A:0.4M 蔗糖，5mM EDTA, 50mM Tris-HCl，1mM 三甲基甘氨酸，8mM 半胱氨酸，0.1% BSA 和 1% PVP，pH 7.8 ；Buffer B:0.4M 蔗糖，ImM EDTA, 1mM Tris-HCl，0.1% BSA, ρΗ7.2 ； 溶液 Wl 葡萄糖，50mM EDTA，25mM Tris-HCl，ρΗ8.0 ； 溶液W2:0.2mM NaOH，1%十二烷基硫酸钠； 溶液 W3:5mol/L 醋酸钾，ρΗ4.8 ； 漂洗液WT:70%酒精；洗脱缓冲液 TB:10mM Tris-HCl，ImM EDTA, PH = 8.0 ； 其中，70 %酒精的百分数为体积比，其余百分数均为质量体积比； (2)预处理 取植物新鲜幼嫩组织于4°C环境中暗处理24h，然后在预冷至2-4°C的蒸馏水中清洗材料或者在终浓度为0.7% (w/v)的次氯酸钠液中浸泡进行消毒； (3)研磨 在预冷的研钵中加入Buffer A，再加入预处理的材料进行研磨；研磨后通过4_8层的医用纱布过滤，收集过滤液并保持其pH在7.0以上； (4)分离线粒体 将收集的过滤液于4°C，1000g离心5±lmin，收集上清；4°C，12000g离心20±2min，弃掉上清；加入Buffer B，用软毛笔重悬绿色沉淀颗粒；然后4°C，100g离心5± lmin，收集上清JPADNase I，放置l_2h ;再加入0.5mol/L EDTA，混匀后静止10±2min，终止反应；40C，12000g 离心 20±2min，弃掉上清； (5)提取线粒体DNA 向沉淀中加入溶液Wl悬浮沉淀；然后加入溶液W2，温和颠倒6-8次，再加入溶液W3，温和颠倒离心管，充分混匀溶液；离心10±2min，吸取上清放入带有核酸硅胶膜的硅胶膜离心吸附柱中，再离心，倒掉废液；向吸附柱中先后2次加入漂洗液WT，离心漂洗吸附柱；最后将吸附柱放入一个干净的离心管中，向核酸硅胶膜中间部位滴加洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，离心2_3min，将溶液收集到离心管中，_20°C保存； 上述步骤(2)-(4)均需要在2-4°C下进行操作。2.如权利要求1所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，采用的材料为非绿色组织，Buffer A用量为2ml/g，以材料的总质量计。3.如权利要求1所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，采用的材料为绿色组织，Buffer A用量为4ml/g，以材料的总质量计。4.如权利要求1所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，所述步骤(4)的Buffer B用量为40ml/g，以材料的总质量计。5.如权利要求4所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，先加入BufferB 5-10ml/g，用软毛笔重悬绿色沉淀颗粒；将重悬液转移到一个新的离心管中，再加入Buffer B 至 40ml/g。6.如权利要求1所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，所述步骤(5)中离心的离心速度均为10000-15000g。7.如权利要求6所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，所述步骤(5)中离心的离心速度均为12000g。8.如权利要求1所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，所述步骤(5)吸附柱放入一个干净的离心管中滴加洗脱缓冲液TB前，再12000g离心2min。9.如权利要求1-8中任意一项所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，所述步骤(5)每Ig材料，采用2ml溶液Wl悬浮后，加入250 μ I溶液W2和350 μ I溶液W3。
【专利摘要】本发明公开了一种植物线粒体DNA的快速提取方法。它首先配制Buffer？A(含有三甲基甘氨酸、半胱氨酸)、Buffer？B(含BSA)、溶液W1、溶液W2、溶液W3、漂洗液WT和洗脱缓冲液TB；然后将新鲜幼嫩组织预处理后，加入Buffer？A研磨，收集过滤液并保持pH7.0以上，收集液经1000g离心后上清液再12000g离心；取沉淀加入Buffer？B重悬，再经1000g离心；取上清加入DNase？Ⅰ和EDTA反应，再12000g离心；向沉淀中加入溶液W1悬浮沉淀；然后加入溶液W2、W3温和颠倒，离心后取上清液采用吸附柱提取线粒体DNA。本发明能高效、快速得获得高质量的植物线粒体DNA。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105112402
【申请号】CN201510585446
【发明人】白静, 王俊峰, 谢坤, 王效睦, 余华, 马玉敏
【申请人】山东省农作物种质资源中心
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月15日