结构如图2所示。
[0028] 实施例3重组表达牙解神经肤的表达、纯化及功能验证
[0029]1、重组蛋白的诱导表达：
[0030]将上述得到的重组载体导入宿主菌Transetta(DE3)，用含lOOug/mL的氨节青霉 素与34ug/mL氯霉素的LB培养基进行扩大培养，WP1，P2为引物进行PCR反应，筛选转化 入正确的重组表达载体的工程菌株并进行测序验证没有碱基突变的发生。
[0031] 将筛选得到的工程菌株单克隆接种于2XYT培养液中（含lOOug/mL的氨节青霉 素与34ug/mL氯霉素）37°C扩大培养至ODe。。约为0. 6时加诱导剂异丙基-P-D-硫代半乳 糖巧（IPTG)至终浓度ImM，37°C诱导表达，并进行间隔1小时的取样，菌液经12,OOOrmp离 屯、lOmin收集细胞并加入细菌裂解液进行超声破碎。超声破碎采取超声4s间隔10s直至 细胞破碎完全。然后经12,OOOrmp离屯、lOmin分离包涵体和上清部分，W分析目标蛋白的 存在状态。结果表明随着诱导时间的增加，重组蛋白的产量也逐步增加（图3);重组蛋白 主要W可溶性状态存在，分子量大小约为23kDa。
[0032] 2、重组蛋白的分离纯化及功能验证 阳03引称取收集的细胞湿重，按照Ig : 10血的比例加入裂解液灯ris-肥1 50mM，邸TA20mM，化Cl lOOmM，Triton-1000. 5%)重悬细胞，并超声波破碎细胞，12, OOOrmp，离屯、 lOmin收集裂解上清液。利用康为世纪公司Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒，将上清 液过预平衡的Ni柱、用lOmM咪挫的洗脱液进行清洗，用肠激酶消化液进行消化，收集消化 后分离得到的牙解神经肤片段，进行透析除盐操作，获得纯化的牙解神经肤。
[0034] 3.纯化神经肤对牙解脑细胞中GnRH的刺激作用
[0035] 取牙解的脑组织启动原代细胞培养，然后将纯化的神经肤形成终浓度为10 "M~ 10 6M的浓度梯度用于细胞处理地。对处理后的细胞进行RNA提取，分析其GnRH mRNA的表 达水平变化。如图4所示，不同浓度的神经肤处理作用于细胞能产生浓度依赖性的GnRH水 平变化。结果表明纯化产生的神经肤具有促进GnRH分泌的作用。
[0036] 实施例4重组表达牙解神经肤工程菌的扩大培养与收集 阳037] 1、工程菌的扩大培养与收集 阳03引选取工程菌进行37°C培养过夜活化。将活化菌W1:50接种于3. 95L的2XYT培 养液中（含lOOug/mL的氨节青霉素与34ug/mL氯霉素）37°C震荡培养，当ODe。。约为0. 6 时加诱导剂异丙基-P-D-硫代半乳糖巧（IPTG)至终浓度lmM，37°C诱导表达4h，菌液经 3,OOOrmp离屯、30min收集细胞。将收集的细胞进行真空冷冻干燥机进行两天两夜干燥W除 净水分W杀死工程菌。结果共收集到0. 81g工程菌制品，诱导4小时后重组蛋白的表达效 率约为24. 38%，则共得到约197. 5mg重组牙解神经肤54蛋白。将得到的冻干粉剂溶解于 33ml的灭菌海水中，制成重组蛋白浓度约为6mg/ml即工程菌浓度约为24. 5mg/ml的母液。
[0039] 实施例5产重组神经肤工程菌在制备饲料添加剂上的应用
[0040] 实验动物选取15月龄的牙解106尾，随机分为两组进行饲喂试验。选取的牙解个 体的平均体重为71. 47 + 19. 82g，平均体长为16. 35 + 1. 68cm。每组按照50g饲料/次X2 次/天进行饲喂，所用饲料为养殖牙解的正常饲料，饲喂饲料量也保证牙解的饱腹和生长 所需。与对照组不同的是，实验组的饲料中按照每lOOg饲料中W喷洒的方式加入1. 5mg重 组蛋白的比例添加重组蛋白。添加时，取250ul母液用海水进行稀释并均匀喷洒在饲料上， 待饲料完全惊干后再饲喂牙解。实验组间隔一天添加一次重组蛋白工程菌添加剂。结果表 明（图5)，14天后对实验组和对照组的牙解抽取血液分离血浆进行其中GnRH及LH两种激 素的化ISA分析。所用试剂盒购于上海酶联生物有限公司。结果表明与对照组相比，实验 组的GnRH水平显著下调（p<0. 05)，但是LH水平没有显著差异变化。结果表明通过饲喂含 有神经肤重组蛋白，牙解的GnRH水平受到直接的调控作用，而运种调控作用主要在GnRH水 平发挥作用，而不会引起短期内脑-垂体-性腺轴最下游激素水平的变化，因此不同于现在 市面上的性激素，也避免了可能的药物残留对消费者健康产生可能的消极作用。
[0041] W常规方式选择水生生物的基础饲料，将上述获得的融合蛋白粉剂作为饲料添加 剂，直接添加于上述基础饲料中混合，使其所占比例为基础饲料重量的0. 0015%，制得具有 调控鱼类性腺发育的水生生物养殖饲料。液体制剂半成品或成品可通过喷洒的方式作用于 喂食前的基础饲料，从而达到人工控制养殖动物性腺发育的目标。
【主权项】
1. 一种牙鲆神经肽，其特征在于，所述的牙鲆神经肽包含有： 1) 氨基酸序列为SEQIDNO: 1的多肽； 2) 在1)的多肽上进行取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中多肽功能的多 肽。2. -种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的牙鲆神经肽。3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQIDN0:2。4. 一种重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体中插入了用于重组表达权利要求 1所述的牙鲆神经肽的全部或部分片段。5. 如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为原核表达载体 pET32a(+)〇6. -种重组宿主菌，其特征在于，所述的重组宿主菌是转化/转染有权利要求4所述的 重组表达载体的宿主菌。7. 如权利要求6所述的重组宿主菌，其特征在于，所述的宿主菌为大肠杆菌。8. 权利要求1所述的牙鲆神经肽在制备饲料添加剂、兽药或医药产品中的应用。9. 权利要求6所述的重组宿主菌作为提供神经肽的组分添加到饲料中的应用。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的饲料为鱼类使用的饲料。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种牙鲆神经肽，其氨基酸序列为SEQ？ID？NO:1；本发明克隆得到牙鲆神经肽的编码序列，并建立和筛选出能有效地进行神经肽重组表达的载体及工程菌，实现了牙鲆神经肽在原核生物体内的融合表达，与传统的多肽合成方法及从天然资源提取多肽的方法相比，本发明的制备方法使得神经肽大批量、低成本的规模化生产成为可能。本发明得到的工程菌可以直接作为饲料添加剂使用，并利用鱼类自身的肠激酶作用释放神经肽发挥其功能，因此可应用于海洋养殖鱼类、养殖禽畜类的饲料添加剂和兽药，解决了养殖业长期存在的难以安全有效地人工控制养殖品种性成熟过程的问题，并以高科技带动了养殖业及养殖饲料工业的行业技术进步。
【IPC分类】C07K14/435, A61P15/00, C12N15/70, C12N15/12, C12N1/21, A61K38/17, C12R1/19
【公开号】CN105198978
【申请号】CN201510612796
【发明人】张全启, 宋华玉, 赵海涛, 李赞, 王旭波, 齐洁, 王志刚, 于海洋, 贺艳
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月24日