一种液态复合微生态制剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种液态复合微生态制剂的制备方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]微生态制剂是作为饲料添加剂直接添加使用的一类制剂。当前，为了解决饲用抗生素引起的药物残留，各国畜牧业都在寻求绿色环保型抗生素替代品。而微生态制剂具有无毒副作用，无药性残留以及效果显著，成本低等诸多优势，是绿色添加剂的首选。
[0003]嗜酸乳杆菌是动物肠道主要益生菌，对肠道健康和生理调控起着重要作用。然而，嗜酸乳杆菌稳定性较弱。目前，市面上的嗜酸乳杆菌制品生产工艺多采用包埋和干燥的技术。若使用全部包埋，无法完全发挥其在胃中的有益作用；而使用干燥的方式难以避免部分菌体的死亡和过程中的能耗，并且生产成本高昂。
[0004]液态复合微生态制剂，利用微生物间的协同作用，发挥了群体的联合作用优势，很好的提高了菌体的稳定性，保持了生物活性，为调节动物生理活性发挥重要作用；而且制备工艺简单，有效的降低了成本，能够产生巨大的经济效益。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种液态复合微生态制剂的制备方法，旨在克服现有技术上乳酸菌稳定性不强，活性不高的问题。本发明对提高禽畜生产性能，特别是提高断奶仔猪的存活率和饲料利用率方面有明显效果。
[0006]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下:
先通过菌株筛选选择发酵活力高，组合生长性能最优的菌种；通过发酵配方优化组合制成液态复合微生态制剂成品。所述液体发酵菌种的制备均单独采用液体发酵:斜面菌种一 200mL三角瓶种子一 20L发酵罐一级种子一 200L发酵罐二级种子，放大至菌种液体体积达100L、菌体数量达到2X109cfu/ml以上。
[0007]—种液态复合微生态制剂的制备方法，筛选发酵活力高，组合生长性能最优的菌种，再将地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌分别进行液体发酵后，将乳酸杆菌发酵液和酿酒酵母菌发酵液1:1等量混合，再加入1~2倍体积的地衣芽孢杆菌发酵液至PH调至5.5-6.5，制成液态复合微生态制剂成品。地衣芽孢杆菌芽孢率为90%-100%。
[0008]液体发酵液的菌液接种量为:地衣芽孢杆菌1_5%，酿酒酵母1_5%，嗜酸乳杆菌
2-10%ο
[0009]地衣芽孢杆菌液体发酵方法为，取保存的地衣芽孢杆菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，180r/min，30-37°C下培养18-24h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，通氧条件下，30-37°C培养18-24h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行培养，通氧条件下，控制温度30-37°C，150r/min，培养18_24h，再调节温度转32-37 °C培养20-30h。地衣芽孢杆菌三角瓶培养基、10L液体发酵培养基，配方均为:葡萄糖1_3%、豆柏2-5%、牛肉膏0.1-1%、氯化钠0.1-1%,水1000mL, PH7.0 ；100L液体发酵培养基，配方为:豆柏2-5%，酵母膏0.1-1%，磷酸氢二钾0.1-1%，磷酸二氢钾0.1-1%，硫酸锰 0.01-0.1%，水 1000mL，ρΗ7.0。
[0010]酿酒酵母菌液体发酵方法为，取保存的酿酒酵母菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，180r/min，28_35°C下培养18-24h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，150r/min，28-35°C下培养18_24h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行二级种子培养，150r/min，28-35°C下发酵18_24h。酿酒酵母菌的三角瓶培养基、20L液体发酵培养基和100L液体发酵培养基，配方均为:葡萄糖1-3%、蛋白胨0.1-1%、氯化钾0.01-0.1%、磷酸二氢钾0.1-1%、硫酸镁0.01-0.1%、硫酸锌0.01-0.1%、硫酸铁 0.01-0.1%，水 1000mL，ρΗ7.0。
[0011]嗜酸乳杆菌液体发酵方法为，取保存的嗜酸乳杆菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，30-37 °C下培养18_24h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，100r/min，30-37°C下培养18_24h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行培养，100r/min, 30_37°C下发酵18-24小时。嗜酸乳杆菌的三角瓶培养基、10L液体发酵培养基和100L液体发酵培养基，配方均为:葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏
0.5%，无水乙酸钠0.5%，柠檬酸钠0.2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.058%，硫酸铵0.02%，吐温 0.1%，水 1000mL，ρΗ6.2-6.6。
[0012]本发明的优点在于:
本发明的复合微生物制剂，菌液能够长期保存。其中地衣芽孢杆菌形成芽孢，处于休眠状态；在协同作用下，嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的稳定性大量提高，能够保持良好的菌体活性。
[0013]本发明的产品生产工艺简单，有效地降低了生产成本；本产品富含乳酸、小肽、免疫多糖、核酸、蛋白酶、生长因子和活性益生菌等，对禽畜作用效果明显，特别是在提高断奶仔猪的存活率和提高饲料利用率方面作用突出。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实例对本发明进行描述。
[0015]实施例1
1.菌种的选择和组合。本发明从枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌中进行选择，通过菌种间拮抗作用测试最终确定地衣芽孢杆菌，酿酒酵母，嗜酸乳杆菌三者组合最佳。
[0016]2.最佳培养配方的确定。运用单因素试验的方法，选定最佳碳源氮源和无机盐比重，根据菌体的生长情况最终确定最佳培养基配方。液体发酵液的菌液接种量为:地衣芽孢杆菌1%，酿酒酵母1%，嗜酸乳杆菌2%。
[0017]3.取保存的地衣芽孢杆菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，180r/min，30°C下培养18h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，通氧条件下，30°C培养18h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行培养，通氧条件下，控制温度30°C，150r/min,培养18h，再调节温度转32°C培养20h。三角瓶培养基、10L液体发酵培养基，配方均为:葡萄糖1%、豆柏2%、牛肉膏0.1%、氯化钠0.1%,水1000mL, PH7.0 ；100L液体发酵培养基，配方为:豆柏2%，酵母膏0.1%，磷酸氢二钾0.1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸锰 0.01%，水 1000mL，ρΗ7.0。
[0018]4.取保存的酿酒酵母菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，180r/min，28-35°C下培养18_24h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，150r/min，28-35°C下培养18-24h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行二级种子培养，150r/min，28-35°C下发酵18_24h。三角瓶培养基、20L液体发酵培养基和100L液体发酵培养基，配方均为:葡萄糖1-3%、蛋白胨0.1-1%、氯化钾0.01-0.1%、磷酸二氢钾0.1-1%、硫酸镁 0.01-0.1%、硫酸锌 0.01-0.1%、硫酸铁 0.01-0.1%，水 1000mL，ρΗ7.0。
[0019]5.取保存的嗜酸乳杆菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，30°C下培养18h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，100r/min，30°C下培养18h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行培养，100r/min，30°C下发酵18小时。三角瓶培养基、10L液体发酵培养基和100L液体发酵培养基，配方均为:葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，无水乙酸钠0.5%，柠檬酸钠0.2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁 0.058%，硫酸铵 0.02%，吐温 0.1%，水 1000mL，ρΗ6.2。
[0020]6.发酵完成后的地衣芽孢杆菌发酵液ΡΗ为8.3，乳酸杆菌发酵液ΡΗ为4.1，酿酒酵母菌发酵液ΡΗ为4.1。将乳酸杆菌发酵液和酿酒酵母菌发酵液1:1等量混合，再加入1倍体积的地衣芽孢杆菌发酵液至ΡΗ调至6即制备完成。该液态微生物制剂菌量可达20亿，保质期三个月。
[0021]实施例2
1.菌种的选择和组合。本发明从枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌中进行选择，通过菌种间拮抗作用测试最终确定地衣芽孢杆菌，酿酒酵母，嗜酸乳杆菌三者组合最佳。
[0022]2.最佳培养配方的确定。运用单因素试验的方法，选定最佳碳源氮源和无机盐比重，根据菌体的生长情况最终确定最佳培养基配方。液体发酵液的菌液接种量为:地衣芽孢杆菌3%，酿酒酵母3%，嗜酸乳杆菌6%。
[0023]3.取保存的地衣芽孢杆菌试管斜面，在无菌室中用无菌水冲洗后，分别接种入2个内装100mL培养基的500mL三角瓶中，180r/min，35°C下培养20h，将总计200mL的种子液合并，进一步放大，接入内装10L培养基的20L液体发酵罐进行一级种子放大，通氧条件下，35°C培养20h，再移种入内装100L培养基的200L液体发酵罐进行培养，通氧条件下，控制温度35°C，150r/min,培养20h，再调节温度转35°C培养25h。三角瓶培养基、10L液体发酵培养基，配方均为:葡萄糖2%、豆柏3%、牛肉膏0.5%、氯化钠0.5%,水lOOOmL，PH7.0 ；100L液体发酵培养基，配方为:豆柏3%，酵母膏0.5%，磷酸氢二钾0.5%，