Zeta电势、粒径、内源 荧光和分子量变化图。
[0026] 图4 :实施例4中不同修饰密度的酸化血清白蛋白与Αβ 42共培养不同时间后培 养物的ThT荧光图。
[0027] 图5 :实施例5中不同浓度酸化血清白蛋白与Αβ 42共培养不同时间后培养物的 ThT荧光图。
[0028] 图6 :实施例6中酸化血清白蛋白与Α β 42共培养24h后培养物的透射电镜图。
[0029] 图7 :实施例7中酸化血清白蛋白与Αβ 42共培养不同时间后培养物的凝胶过滤 色谱图。
[0030] 图8 :实施例8中不同浓度酸化血清白蛋白与Α β 42共培养24h后培养物对PC12 的细胞存活率。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0032] 首先在血清白蛋白表面修饰二甘醇酐，提高其表面的负电荷数量，制备得到酸化 血清白蛋白。
[0033] 具体的示意结构如下：
[0035] 多种实验手段证明，酸化血清白蛋白可以有效抑制Α β 42聚集，并能降低Α β 42聚 集过程中所产生的细胞毒性。酸化血清白蛋白抑制Α β 42聚集体生成的能力是通过ThT荧 光、透射电镜和凝胶过滤色谱等方法测定的，其降低Αβ 42聚集过程中所产生的细胞毒性 的能力是通过ΜΤΤ细胞毒性实验测定的。
[0036] 实施例1 :二甘醇酐与血清白蛋白的摩尔比为10的酸化血清白蛋白合成与表征
[0037] 称取100mg血清白蛋白，溶解于20mL去离子水中，得到浓度为5mg/mL的血清白蛋 白溶液。称取1. 75mg二甘醇酐粉末，加入到血清白蛋白溶液中，同时滴加 lmol/L氢氧化钠 溶液维持反应液的pH稳定在6. 0。上述混合物在170rpm和室温下搅拌反应0. 5h。反应后 通过SephadexG-25凝胶过滤色谱柱除去体系中游离的二甘醇酐，得到的产物（酸化血清白 蛋白1)冷冻干燥后保存。
[0038] 称取血清白蛋白和酸化血清白蛋白1各2mg，分别溶于pH 3·0、4·0、5·0、6·0、7·0、 8. 0、9. 0的2ml缓冲液中；在25°C条件下，通过电位分析仪（Malvern Instruments)分别测 定不同pH条件下，相同浓度的血清白蛋白和酸化血清白蛋白1的Zeta电势变化。
[0039] 称取血清白蛋白和酸化血清白蛋白1各2mg，溶于2ml pH 7. 4的磷酸盐缓冲液中； 在25°C条件下，通过荧光分光光度计测定其在280nm激发波长下的内源荧光强度变化，对 比酸化前后血清白蛋白分子结构的变化；通过粒径分析仪（Malvern Instruments)分析酸 化前后血清白蛋白分子尺寸的变化。
[0040] 称取血清白蛋白和酸化血清白蛋白1各lmg，溶于1ml去离子水中，通过质谱仪分 析酸化血清白蛋白1的分子量，从而确定酸化血清白蛋白1的平均修饰率。
[0041] 由图1A可知，在pH 3-9的范围内，酸化血清白蛋白1的Zeta电势较血清白蛋白明 显降低，说明修饰二甘醇酐后，血清白蛋白表面带有更多的羧基，从而降低了其Zeta电势， 使其表面带有更多的负电荷。酸化血清白蛋白1的等电点为4. 3。
[0042] 如图1B所示，血清白蛋白粒径为8. lnm，而酸化血清白蛋白1的粒径为7. 6nm，说 明修饰后血清白蛋白的粒径变化不大，仍然保持为球状结构。
[0043] 如图1C所示，在280nm激发下血清白蛋白和酸化血清白蛋白1的内源荧光强度和 出峰位置基本保持一致，说明酸化修饰后的血清白蛋白空间结构仍保持紧凑，且和天然态 基本保持一致。说明酸化这种修饰方法在保证不改变蛋白质空间结构和稳定性的前提下， 可以有效的提高其表面所带负电荷，可以广泛的利用到其他蛋白质的修饰上。
[0044] 如图1D所示，酸化血清白蛋白1的分子量为66817Da，天然血清白蛋白的分子量为 66469Da，所以酸化血清白蛋白1的二甘醇酐平均修饰数目η为3。
[0045] 实施例2 :二甘醇酐与血清白蛋白的摩尔比为100的酸化血清白蛋白合成与表征
[0046] 称取200mg血清白蛋白，溶解于20mL去离子水中，得到浓度为10mg/mL的血清白 蛋白溶液。称取35. 07mg二甘醇酐粉末，加入到血清白蛋白溶液中，同时滴加 lmol/L氢氧 化钠溶液维持反应液的pH稳定在6. 5。上述混合物在170rpm和室温下搅拌反应2h。反应 后通过SephadexG-25凝胶过滤色谱柱除去体系中游离的二甘醇酐，得到的产物（酸化血清 白蛋白2)冷冻干燥后保存。
[0047] 称取血清白蛋白和酸化血清白蛋白2各2mg，分别溶于pH 3· 0、4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、 8. 0、9. 0的2ml缓冲液中，在25°C条件下，通过电位分析仪（Malvern Instruments)分别测 定不同pH条件下，相同浓度的血清白蛋白和酸化血清白蛋白2的Zeta电势变化。
[0048] 称取血清白蛋白和酸化血清白蛋白2各2mg，溶于2ml pH 7. 4的磷酸盐缓冲液中； 在25°C条件下，通过荧光分光光度计测定其在280nm激发波长下的内源荧光强度变化，对 比酸化前后血清白蛋白分子结构的变化；通过粒径分析仪（Malvern Instruments)分析酸 化前后血清白蛋白分子尺寸的变化。
[0049] 称取血清白蛋白和酸化血清白蛋白2各lmg，溶于1ml去离子水中，通过质谱仪分 析酸化血清白蛋白2的分子量，从而确定酸化血清白蛋白2的平均修饰率。
[0050] 由图2A可知，在pH 3-9的范围内，酸化血清白蛋白2的Zeta电势较血清白蛋白 明显降低，说明修饰二甘醇酐后，血清白蛋白表面带有更多的羧基，从而降低了其Zeta电 势，使其表面带有更多的负电荷。酸化血清白蛋白2的等电点为4.0,而且酸化血清白蛋白 2的Zeta电势低于酸化血清白蛋白1，说明合成过程中，二甘醇酐与血清白蛋白的摩尔比越 大，合成的酸化血清白蛋白所带负电荷越多。
[0051] 如图2B所示，血清白蛋白粒径为7. 9nm，而酸化血清白蛋白2的粒径为8. lnm，说 明修饰后血清白蛋白的粒径变化不大，仍然保持为球状结构。
[0052] 如图2C所示，在280nm激发下血清白蛋白和酸化血清白蛋白2的内源荧光强度和 出峰位置基本保持一致，说明酸化修饰后的血清白蛋白空间结构仍保持紧凑，且和天然态 基本保持一致。说明酸化这种修饰方法在保证不改变蛋白质空间结构和稳定性的前提下， 可以有效的提高其表面所带负电荷，可以广泛的利用到其他蛋白质的修饰上。
[0053] 如图2D所示，酸化血清白蛋白2的分子量为67861Da，天然血清白蛋白的分子量为 66469Da，所以酸化血清白蛋白2的二甘醇酐平均修饰数目η为12。
[0054] 实施例3 :二甘醇酐与血清白蛋白的摩尔比为400的酸化血清白蛋白合成与表征
[0055] 称取400mg血清白蛋白，溶解于20mL去离子水中，得到浓度为20mg/mL的血清白 蛋白溶液。称取280. 53mg二甘醇酐粉末，加入到血清白蛋白溶液中，同时滴加 lmol/L氢氧 化钠溶液以维持反应液的pH稳定在7. 0。上述混合物在170rpm和室温下搅拌反应5h。反 应后通过SephadexG-25凝胶过滤色谱柱除去体系中游离的二甘醇酐，得到的产物（酸化血 清白蛋白3)冷冻干燥后保存。
[0056] 称取血清白蛋白和酸化血