，而含有40 μ mol/L的酸化血 清白蛋白样品中，仅出现少量的短棒状聚集体。这说明酸化血清白蛋白的存在改变了 Α β 42 聚集体形貌，阻止了其向纤维的转化。
[0079] 实施例7 :酸化血清白蛋白与Αβ 42共培养不同时间后培养物的聚集体大小分布 [0080] 用实施例3中合成的酸化血清白蛋白3来考察其对Αβ 42聚集体大小分布的影 响。
[0081] 按照与实施例4相同的方法处理Α β 42分子，并配制含40 μ mol/L酸化血清白蛋 白的Α β 42培养液，其中Α β 42终浓度为40 μ mol/L，艮P溶液中Α β 42与酸化血清白蛋白的 浓度比为1: 1、，将上述溶液置于37°C，150rpm条件下进行培养。在不同培养时间下，取lmL 培养液通过220nm滤膜过滤后，通过Superdex 75HR 10/30凝胶过滤色谱柱进行分析，结果 如图7所示。随着培养时间的延长（如图7A，7B)，Αβ 42更多的聚集形成寡聚体，单体含量 逐渐减少，而加入酸化血清白蛋白后，Αβ 42单体浓度仍保持在较高水平。上述结果表明， 酸化血清白蛋白减缓了 Αβ 42的单体结构向寡聚体转化的过程，使更多的Αβ 42保持在单 体形态，从而有效抑制其聚集。
[0082] 实施例8 :不同浓度酸化血清白蛋白与Α β 42共培养24h后培养物对PC12的细胞 毒性
[0083] 用实施例3中合成的酸化血清白蛋白3来考察其对Αβ 42聚集体细胞毒性的影 响。
[0084] 细胞毒性实验中使用的细胞为鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株（PC12)。首先取PC12低分 化细胞，用含有10 %胎牛血清和1 %青霉素-链霉素的DMEM培养基进行培养，并向培养基 中加入神经细胞生长因子（nerve growth ractor，NGF)，使其终浓度为50ng/mL，5%C02, 37°C培养3天。观察到PC12细胞在NGF诱导下长出较长的突起，成为高分化细胞后向培 养瓶中加入含有〇. 4%胰酶和0. 04% EDTA的溶液对PC12高分化细胞进行消化，再用含有 10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基以适当浓度稀释细胞，以5X103cell/ 孔的细胞浓度加入到96孔板，每孔90μ 1。5% C02,37°C培养24h后进行细胞毒性实验。
[0085] 配制酸化血清白蛋白浓度为880、440、220、44ymol/L的PBS溶液。先向上述96 孔板中加入不同浓度的酸化血清白蛋白溶液10μ 1/孔。之后向96孔板中加入与实施例1 相同方法处理的Α β 42溶液10 μ 1/孔。空白对照孔中不加酸化血清白蛋白和Α β 42溶液， 而加入PBS缓冲液20 μ 1/孔。最终使加药孔每孔中酸化血清白蛋白终浓度为80、40、20、 4ymol/L，Αβ42的终浓度为40ymol/L，即Αβ42与酸化血清白蛋白浓度比为1:2、1:1、 1:0. 5和1:0. 1。细胞在培养箱中以5% C02, 37°C条件培养24h后，加入10 μ L的ΜΤΤ溶液， 使得培养基中ΜΤΤ的终浓度为0. 5mg/ml。在5% C02, 37°C条件下继续培养4h。
[0086] 将96孔板以1500rpm的速度离心10min，离心后移除96孔板中溶液，每孔加入 100 μ L的DMS0摇床震荡lOmin，检测570nm处吸光值。将培养基中不含Α β 42和酸化血清 白蛋白的孔作为空白对照组，记为PC12细胞活性为100%，然后将其作为对照计算加药组 的细胞存活率（图8)。实验中每个酸化血清白蛋白浓度梯度设置6个复孔。
[0087] 由图8可知，Αβ 42单独存在时，细胞存活率为50. 13%。而加入不同浓度的酸化 血清白蛋白（80、40、20、4ymol/L)后PC12细胞存活率提高到90·89%、88·1%、76·96%、 58. 73%，说明酸化血清白蛋白能够有效抑制Α β 42寡聚体产生的细胞毒性。
[0088] 本发明涉及了在血清白蛋白表面氨基上，通过化学修饰的方法修饰二甘醇酐，从 而提高其表面负电荷，制备得到酸化血清白蛋白的技术。公开了酸化血清白蛋白在制备抑 制β-淀粉样蛋白聚集的药物的用途。多种实验手段证明，酸化血清白蛋白的空间结构和 稳定性与天然血清白蛋白类似，而其表面负电荷数量明显增加，说明这种修饰方法是一种 温和有效的方法。此外多种实验手段证明酸化血清白蛋白能够有效抑制Αβ42的聚集；并 能改变Α β 42的聚集路径以及聚集体的形态，并有效抑制Α β 42聚集体对细胞产生的毒性。 酸化血清白蛋白作为一种潜在的新药，可以有效抑制Αβ 42的聚集及其构象变化过程，并 降低Α β 42聚集过程中所产生的细胞毒性作用，是Α β 42聚集的理想抑制剂。
[0089] 本发明提出了在血清白蛋白的基础上，通过化学修饰的方法，使其表面带有更多 的负电荷，制备得到酸化血清白蛋白，拥有良好的稳定性和生物相容性。并提出了酸化血清 白蛋白在制备抑制β -淀粉样蛋白聚集的药物等方面的用途，并将其应用于Αβ 42的构象 变化、聚集和细胞毒性抑制实验，已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显 能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来 实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替代和改动对本领域技术人员来说是 显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
【主权项】
1. 一种酸化血清白蛋白，其特征在于，在血清白蛋白表面的氨基上修饰二甘醇酐，得到 的等电点为3. 8~4. 3且二甘醇酐平均修饰数目为3~14. 5的产物。2. 权利要求1的酸化血清白蛋白制备方法，其特征在于：向溶解于去离子水的且浓度 为1~20mg/mL血清白蛋白溶液中加入二甘醇酐粉末，同时滴加氢氧化钠溶液维持反应液 的pH稳定在6. 0~7. 0,然后在室温下搅拌反应0. 5~5h;除去游离二甘醇酐得到酸化血 清白蛋白。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：二甘醇酐与血清白蛋白的摩尔比为10~ 400 :1〇4. 酸化血清白蛋白具有抑制β_淀粉样蛋白聚集的作用。5. 酸化血清白蛋白具有抑制β_淀粉样蛋白Αβ聚集，降低β-淀粉样蛋白聚集体的 细胞毒性。6. 酸化血清白蛋白用于治疗因β_淀粉样蛋白聚集的相关疾病的药物。7. 酸化血清白蛋白用于治疗因β_淀粉样蛋白聚集的阿尔兹海默病的药物。
【专利摘要】本发明涉及一种及制备方法和在抑制β-淀粉样蛋白聚集的应用。酸化白蛋白是在血清白蛋白表面的氨基上修饰二甘醇酐，得到的等电点为3.8～4.3且二甘醇酐平均修饰数目介于3-14.5的产物。向溶解于去离子水的且浓度为1～20mg/mL血清白蛋白溶液中加入二甘醇酐粉末，同时滴加氢氧化钠溶液以维持反应液的pH稳定在6.0～7.0，在室温下搅拌反应0.5～5h；除去游离二甘醇酐得到分子结构稳定的酸化血清白蛋白。本发明合成酸化血清白蛋白，提高血清白蛋白表面的负电荷数量，促进其与Aβ相互作用，从而抑制Aβ聚集，并降低β-淀粉样蛋白聚集体的细胞毒性。用于治疗阿尔兹海默病和β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病药物。
【IPC分类】A61K38/38, C07K14/765, A61P25/28, C07K1/113
【公开号】CN105315361
【申请号】CN201410366671
【发明人】孙彦, 谢宝龙, 史清洪, 董晓燕
【申请人】天津大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年7月29日