特异性），使得设计的PCR产物纯度 较高。本发明的这种设计可以使得PCR扩增产物条带清楚，无杂带出现，易于电泳识别。但 是，如果温度过低，则特异条带少且杂带过多，电泳后难以区分判断；如果温度过高，则影响 PCR扩增效率使得特定扩增产物过少，影响观察效果。
[0024] 在本发明的优选实施例中，通过控制PCR扩增程序中延伸时间的范围在10~60s 之间，优选时间15~30s (该时间可提高扩增反应的效率和扩增产物的特异性），使得设计 的PCR反应时间较短，扩增产物纯度较高。本发明的这种设计可以使PCR扩增产物条带清 楚，无杂带出现，易于电泳识别，而且PCR时间较短。但是，如果时间过短，则特异条带不能 完全扩增而使得扩增产物较少，电泳后难以区分判断；如果时间过长，则增加非特异条带的 出现几率，出现杂带影响观察效果。
[0025] 在本发明中，PCR反应成分可以包含DNA模板、上下游引物、Taq DNA polymerase (DNA聚合酶或亦可称作"Taq酶"）、缓冲液、Mg2+等。在本发明的优选实施例 中，PCR 扩增反应中可以使用 Taq DNA polymerase 及其 Taq Antibody。Taq Antibody 是 Taq DNA polymerase的单克隆抗体，其与Taq DNA polymerase结合后抑制DNA聚合酶活 性，两者的亲和力非常高，即使在65°C下仍然可以封闭Taq DNA polymerase的活性，因此 可以非常有效地抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增，具有极高的 扩增灵敏度和特异性。Taq Antibody只需要在95°C加热30s即可完全失活，释放Taq DNA polymerase活性，保证了后续PCR扩增反应能够顺利进行。
[0026] PCR反应中可以加入pH值为8. 1~8. 7的Tris-HCl缓冲液，在72°C延伸反应时 调整PCR溶液pH值在6. 8~7. 8之间，从而使Taq酶在偏碱性环境中更好地发挥活性。另 外，PCR溶液中还可以加入明胶（0.01%)以减少PCR管对Taq酶的吸附作用，稳定酶活性 及保护作用，促进PCR反应。
[0027] 另外，PCR溶液中Mg2+浓度在1. 5~2. 0mmol/L之间时，可以很好地控制PCR反应 的产率和特异性。
[0028] PCR反应引物的终浓度一般为0. 1~1 μΜ左右，浓度太高会导致非特异性扩增，太 低则扩增产物太少。
[0029] 此外，PCR反应中还可以加入助溶剂二甲亚砜（DMS0)和硫酸铵以降低碱基错配水 平，提高富含GC模板的扩增效率。这可能与消除引物和模板的二级结构，降低DNA解链温 度使DNA变性完全有关。
[0030] 根据本发明的另一方面，提供了一种用于测定人NEFM基因 rsl2515位点多态性的 试剂盒，其包含：
[0031] 用于PCR扩增人NEFM基因 rs 12515位点附近序列的上游引物和下游引物，其中上 游引物具有错配碱基G以获得含GTAAAY片段的扩增产物，其中Y为人NEFM基因 rsl2515 位点上的待定碱基C或T ;以及
[0032] 仅能够切开GTAAAC片段与GTAAAT片段之一的限制性内切酶。
[0033] 上述试剂盒中还可以包括其它成分，例如PCR反应Mix(包括4种dNTP混合物、 Mg2+、Taq DNA polymerase、Taq Antibody、缓冲液，DMS0和硫酸铵）和用于实施测定的说明 书等。
[0034] 本领域技术人员可以理解，除非有明显抵触，本发明的第一方面和第二方面的相 关特征可以相互组合。
[0035] 本发明的测定手段不但快速可靠，而且测定成本大大降低。
【附图说明】
[0036] 图1描述了根据本发明的方法获得的酶切产物电泳紫外照片。其中Marker是：标 准参考位置；泳道1 :TT基因型；泳道2 :TC基因型；泳道3 :CC基因型。
【具体实施方式】
[0037] 下面对本发明进行详细描述。本领域技术人员应当理解，以下详细描述仅用于说 明而非限定本发明。
[0038] (1)待测DNA的获取
[0039] 采集不同人群外周血，提取基因组DNA后进行下面的NEFM基因 rs 12515位点多态 性的测定。
[0040] 对于待测DNA的选择，本发明并没有特别的限制。既可以是从人体的体液或者组 织获得离体样本，还可以是经过预先降解处理的基因组。为了方便实施，通常优选从血液提 取离体样本。其中所述的组织包括人体中含有全部或至少NEFM基因的组织，而与是否表达 该NEFM基因无关。从体液和/或组织中提取DNA的方法是本领域技术人员公知的，并且可 以参考常用的分子生物学手册，例如《实用流式细胞术彩色图谱》、《分子克隆》第2版等。
[0041] ⑵引物设计与合成
[0042] 查找NCBI网站的Gene数据库和SNP数据库，分别获得NEFM基因全序列和rs 12515 多态位点信息。rsl2515多态位点y前后部分碱基序列（碱基序列以5' 一3'表示，大小写 意义相同）如下（SEQ ID N0:1):
[0043]
[0044] 根据上述序列设计引入错配碱基的上游引物和下游引物。在最终所得扩增产物 上，上游引物的错配碱基G与Y之间相隔四个碱基TAAA。
[0045] 在本发明中，上游引物具有错配碱基G，且长度为35~60bp。下游引物也引入错 配碱基C，目的是消除PCR产物序列该碱基位置附近的GTNNAC序列并消除该酶切位点。其 中一个实施例中的引物如下：
[0046] 上游引物：5'TGTATTATGC MAGTACCAA CTGAGCCAAA AACA￡TAAA 3'（SEQ ID N0:2)，
[0047] 下游引物：5'AAAAGTCCAT ITTAAATGCA CCAGTGAG￡T 3'（SEQ ID N0:3)，
[0048] 其中上、下游引物下划线碱基均为错配碱基。
[0049] (3)制备PCR扩增产物
[0050] 根据上游引物和下游引物特征及PCR相应试剂制定PCR扩增程序和条件，制备 PCR扩增产物。其中一个实施例中，取基因组DNA(50~80ng)、上下游引物（终浓度为 0·~1 μΜ)、2XPCR Mix7. 5 μ L(包括 4 种 dNTP 混合物、Mg2+、Taq DNA polymerase、Taq Antibody、缓冲液，DMSO和硫酸铵）和双蒸水共同组成15 μ L反应体系，调整溶液pH为7. 3 左右。PCR反应条件为：95°C预变性30s，95°C变性30s - 63°C退火30s - 72°C延伸20s共 30个循环，72°C延伸7min。PCR反应后获得稳定的扩增产物。
[0051] (4)酶切反应
[0052] 本发明采用内切酶Hpyl66II的价格低廉，如表1所示。
[0053] 表1 NEB公司Hpyl66II内切酶识别序列及其价格
[0055] 注：N为A或T或G或C。
[0056] 其中一个实施例中，取PCR产物10yL，加入限制性内切酶Hpyl66II 5U、2yL 10X酶切缓冲液和7. 5 μ L双蒸水组成20 μ L反应体系，37°C水浴中酶切4~12h，即得酶 切产物，酶切产物经1倍浓缩后电泳观察。
[0057] (5)电泳测试
[0058] 其中一个实施例中，PCR产物经Hpyl66II酶切后如果不能切开则仍为119bp，如果 被切开则出现82bp和37bp，其中37bp片段电泳图中难以分辨。
[0059] 将酶切产物在2~4%琼脂糖凝胶中3~8V/cm条件下，电泳30~80min，于紫外 灯下拍照测定。酶切电泳图见图1，依据119bp和82bp片段的有无判断来判断基因型：CC 型为82bp -个片段，CT型有119bp和82bp两种片段，TT型为119bp -个片段。
[0060] 下面是实施本发明的若干实施例。
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