0061] 实施例1提取人外周血白细胞DNA测定rsl2515多态性
[0062] 1材料与方法
[0063] 1. 1主要试剂及仪器
[0064] 试剂：2XPCR Mix(包括 4 种 dNTP 混合物、Mg2+、Taq DNA polymerase、Taq Antibody、缓冲液，DMSO和硫酸铵），限制性内切酶Hpyl66II (NEB公司），琼脂糖（Biowest 公司），引物由上海Sangon公司合成。
[0065] 仪器：9600 型 PCR 仪（PE 公司），微型电泳槽（Pharmacia Biotech, EPS1000)，Gel Doc 2000凝胶成像仪（Bio-RAD公司）。
[0066] 1. 2从外周血白细胞中提取DNA作为待测基因组DNA模板
[0067] EDTA_K2抗凝管采集人外周血lmL，参考《实用流式细胞术彩色图谱》中白细胞的分 离方法进行白细胞分离，参考《分子克隆》中氯化钠盐析法提取白细胞基因组DNA，并作为待 测人基因组DNA模板。
[0068] 1. 3序列查找及引物设计
[0069] 在NCBI网站查找NEFM基因序列和rsl2515多态位点信息来设计引物，具体如下：
[0070] 上游引物：5'TGTATTATGC MAGTACCAA CTGAGCCAAA AACA￡TAAA 3'（SEQ ID N0:2)，
[0071] 下游引物：5'AAAAGTCCAT ITTAAATGCA CCAGTGAG￡T 3'（SEQ ID N0:3)。
[0072] 1.4PCR 扩增
[0073] 取基因组DNA(50~80ng)、上下游引物（终浓度为0· 1~1 yM)、2XPCR Mix 7.5以1^(包括4种(11^1：)混合物、]\%2+、1&9〇嫩。〇15〇116抑86、1&9 4111:;[130(17、缓冲液，0]\130和 硫酸铵），灭菌双蒸水补足15 μ L反应体系，调整溶液pH为7. 3左右。
[0074] PCR反应条件为：95°C预变性30s，95°C变性30s - 63°C退火30s - 72°C延伸20s 共30个循环，72°C延伸7min。PCR反应后获得稳定的扩增产物。
[0075] 1. 5酶切鉴定
[0076] 取PCR产物10 μ L，加入5U内切酶Hpyl66II、2 μ L 10X酶切缓冲液和7. 5 μ L双 蒸水组成20 μ L反应体系，37 °C水浴中酶切12h，即得酶切产物，酶切产物经1倍浓缩后电泳 观察。
[0077] 上述酶切产物在3%琼脂糖凝胶5V/cm条件下，电泳40min，于紫外灯下拍照鉴定 多态类型。
[0078] 2 结果
[0079] 2. 1PCR扩增结果
[0080] 扩增后序列（其位于SEQ ID NO: 1碱基序列中462-580处，共119bp)，所获得的扩 增产物序列如下（SEQ ID NO:4):
[0082] 扩增后产物序列中下划线部分分别为上游、下游引物所对应的序列，y代表C/T多 态即SNP位点rsl2515。
[0083] 2. 2酶切结果
[0084] 经内切酶Hpyl66II酶切后的产物序列分别如下：
[0085] 该多态位点含有C等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段82bp序列（SEQ ID NO:5)：
[0087] 该多态位点含有C等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段37bp序列（SEQ ID NO:6)：
[0088] tgtattatgc aaagtaccaa ctgagccaaa aacagta 37
[0089] 酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，结果示于图1中。其中，rsl2515位点扩增 后出现119bp片断，经Hpyl66II酶切后电泳会出现119bp、82bp和37bp三种片断（其中 37bp在电泳图中不易分辨）。
[0090] 酶切后基因型判断：如图1所示，CC型为82bp-个片段，CT型有119bp和82bp两 种片段，TT型为119bp -个片段。
[0091] 2. 3NEFM基因 rsl2515位点多态结果
[0092] 共检测30例人员，检测结果发现rsl2515位点出现CC型9例、CT型13例和TT型 8例。
[0093] 实施例2人外周血全血标本测定NEFM基因 rsl2515多态性
[0094] 主要试剂及仪器同实施例1 ;参考《分子克隆技术》中酚-氯仿抽提法提取外周血 全血基因组DNA，并作为待测人基因组DNA模板。
[0095] 序列查找同实施例1，PCR反应所采用的上游引物是SEQ ID N0:7,下游引物是SEQ ID N0:8〇
[0096] 上游引物：5'GATGTCTTGA GATGTATTAT GCAAAGTACC ACTGAGCCAA AAACA￡TAA 3'（SEQ ID NO :7);
[0097] 下游引物：5'CAAAAGTCCA TITTAAATGC ACCAGTGAG￡ T 3'（SEQ ID N0:8)。
[0098] 取基因组DNA(50~80ng)、上下游引物（终浓度为0· 1~1 yM)、2XPCR Mix 10 μ L(包括 4 种 dNTP 混合物、Mg2+、Taq DNA polymerase、Taq Antibody、缓冲液，DMS0 和 硫酸铵），灭菌双蒸水补足20 μ L反应体系，调整溶液pH为7. 3左右。
[0099] PCR反应条件为：95°C预变性3min，95°C变性30s - 63°C退火30s - 72°C延伸20s 共30个循环，72°C延伸10min。
[0100] 酶切反应同实施例1。酶切产物经1倍浓缩后在3%琼脂糖凝胶5V/cm条件下，电 泳45min，于紫外灯下拍照鉴定。
[0101] 结果：
[0102] 扩增后序列（其位于SEQ ID NO: 1碱基序列中450-581处，共132bp)，所获得的扩 增产物序列如下（SEQ ID N0:9):
[0104] 扩增后产物序列中下划线部分为上游、下游引物所对应的序列，y代表C/T多态即 SNP 位点 rsl2515。
[0105] 经内切酶Hpyl66II酶切后的产物序列分别如下：
[0106] 该多态位点含有C等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段83bp序列（SEQ ID NO:10)：
[0108] 该多态位点含有C等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段49bp序列（SEQ ID NO:11)：
[0109] gatgtcttga gatgtattat gcaaagtacc aactgagcca aaaacagta 49
[0110] 酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，rsl2515位点扩增后出现132bp片断，经 Hpyl66II酶切后电泳会出现132bp、83bp和49bp (其中49bp在电泳图中不易分辨）三种片 断。
[0111] 酶切后基因型判断：CC型为83bp-个片段，CT型有132bp和83bp两种片段，TT 型为132bp -个片段。
[0112] 共检测28例人员，检测结果发现rsl2515位点出现CC型8例、CT型14例和TT型 6例。
[0113] 实施例3人外周血血凝块标本测定NEFM基因 rsl2515多态性
[0114] 主要试剂及仪器同实施例1 ;参考《分子克隆技术》中酚-氯仿抽提法提取血凝块 基因组DNA。
[0115] PCR反应所采用的上游引物是SEQ ID N0:12,下游引物是SEQ ID N0:13。
[0116] 上游引物：5'TGTCTTGAGA TGTATTATGC AAAGTACCAA CTGAGCCAAA AACA￡TA 3'（SEQ ID NO:12)；
[0117] 下游引物：