5'CCAITTTAAA TGCACCAGTG AG￡TAAACAT AAT 3'（SEQ ID N0:13)。
[0118] PCR扩增除退火温度是65 °C外，其余反应条件同实施例1 ;酶切反应同实施例1。 酶切产物经1倍浓缩后在3%琼脂糖凝胶5V/cm条件下，电泳45min，于紫外灯下拍照鉴定。
[0119] 结果：
[0120] 扩增后序列（其位于SEQ ID NO: 1碱基序列中452-574处，共123bp)，所获得的扩 增产物序列如下（SEQ ID N0:14):
[0121]
[0122] 扩增后产物序列中下划线部分为上游、下游引物所对应的序列，y代表C/T多态即 SNP 位点 rsl2515。
[0123] 经内切酶Hpyl66II酶切后的产物序列分别如下：
[0124] 该多态位点含有C等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段76bp序列（SEQ ID NO:15)：
[0126] 该多态位点含有C等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段47bp序列（SEQ ID NO:16)：
[0127] tgtcttgaga tgtattatgc aaagtaccaa ctgagccaaa aacagta 47
[0128] 酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，rsl2515位点扩增后出现123bp片断，经 Hpyl66II酶切后电泳会出现123bp、76bp和47bp (其中47bp在电泳图中不易分辨）三种片 断。
[0129] 酶切后基因型判断：CC型为76bp -个片段，CT型有123bp和76bp两种片段，TT 型为123bp -个片段。
[0130] 多态结果，共检测42例人员，检测结果发现rsl2515位点出现CC型13例、CT型 18例和TT型11例。
[0131] 实施例4人口腔黏膜细胞测定NEFM基因 rsl2515多态性
[0132] 主要试剂及仪器同实施例1 ;参考《分子克隆技术》中酚-氯仿抽提法提取口腔黏 膜细胞基因组DNA。
[0133] PCR反应所采用的上游引物是SEQ ID N0:17,下游引物是SEQ ID N0:18。
[0134] 上游引物：5'GAGATGTATT ATGCAAAGTA CCAACTGAGC CAAAAACAQT 3'（SEQ ID NO:17)；
[0135] 下游引物：5'AGTCCAITTT AAATGCACCA GTGAG￡TAAA CAT 3'（SEQ ID N0:18)
[0136] PCR扩增除退火温度是68 °C外，其余反应条件同实施例1 ;酶切反应同实施例1。 酶切产物经1倍浓缩后在3%琼脂糖凝胶5V/cm条件下，电泳45min，于紫外灯下拍照鉴定。
[0137] 结果：
[0138] 扩增后序列（其位于SEQ ID NO: 1碱基序列中458-577处，共120bp)，所获得的扩 增产物序列如下（SEQ ID N0:19):
[0140] 扩增后产物序列中下划线部分为上游、下游引物所对应的序列，y代表C/T多态即 SNP 位点 rsl2515。
[0141] 经内切酶Hpyl66II酶切后的产物序列分别如下：
[0142] 该多态位点含有C等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段80bp序列（SEQ ID NO:20)：
[0144] 该多态位点含有C等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段40bp序列（SEQ ID N0:21)：
[0145] gagatgtatt atgcaaagta ccaactgagc caaaaacagt 40
[0146] 酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，rsl2515位点扩增后出现120bp片断，经 Hpyl66II酶切后电泳会出现120bp、80bp和40bp (其中40bp在电泳图中不易分辨）三种片 断。
[0147] 酶切后基因型判断：CC型为80bp -个片段，CT型有120bp和80bp两种片段，TT 为120bp -个片段。
[0148] 多态结果，共检测58例人员，检测结果发现rsl2515位点出现CC型16例、CT型 27例和TT型15例。
【主权项】
1. 一种测定人NEFM基因rsl2515位点多态性的方法，包括： 提供待测人基因组DNA; 提供扩增人NEFM基因rsl2515位点附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引物具 有错配碱基G; 以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以获得 含GTAAAY片段的扩增产物，其中Y为人NEFM基因rsl2515位点上的待定碱基C或T; 提供限制性内切酶； 利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切以获得相应的酶切产物；以及 根据所得酶切产物来确定人NEFM基因rsl2515位点上的待定碱基Y是C还是T， 其中，限制性内切酶为仅能够切开GTAAAC片段与GTAAAT片段之一的限制性内切酶。2. 根据权利要求1所述的方法，其中在所得扩增产物上，上游引物的错配碱基G与Y之 间相隔四个碱基TAAA。3. 根据权利要求2所述的方法，其中在所得扩增产物上，上游引物末端碱基与Y相邻。4. 根据权利要求2所述的方法，其中在所得扩增产物上，上游引物末端碱基不与Y相 邻。5. 根据权利要求1所述的方法，其中限制性内切酶为仅能切开GTAAAC片段的 Hpyl66II或其同裂酶。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所得酶切产物包括三种片段类型：具有总片段长 度的未切断扩增产物、切断后具有较长片段的扩增产物以及切断后具有较短片段的扩增产 物，通过判断酶切产物所包含的片段类型来确定人NEFM基因rsl2515位点上的待定碱基Y 是C还是T〇7. 根据权利要求6所述的方法，其中判断酶切产物所包含的片段类型是通过凝胶电泳 联合紫外灯拍照后与参照图对比来进行的。8. 根据权利要求7所述的方法，其中参照图是扩增产物在凝胶电泳标准设定时间后经 紫外灯拍照后而得且仅具有第一参照图像位置和第二参照图像位置，其中第一参照图像位 置针对的是未切断的总片段长度的扩增产物，而第二参照图像位置则针对的是切断后具有 较长片段的扩增产物。9. 根据权利要求1所述的方法，其中通过设计上游引物和下游引物的长度而使得扩增 产物的总片段长度在100至300bp之间，并且上游引物的片段长度至少为35bp，使得酶切切 掉部分片段占总片段的长度的百分比超过20%。10. -种用于测定人NEFM基因rsl2515位点多态性的试剂盒，其包含： 用于PCR扩增人NEFM基因rsl2515位点附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引 物具有错配碱基G以获得含GTAAAY片段的扩增产物，其中Y为人NEFM基因rsl2515位点 上的待定碱基C或T;以及 仅能够切开GTAAAC片段与GTAAAT片段片段之一的限制性内切酶。
【专利摘要】测定人NEFM基因rs12515位点多态性的方法及试剂盒。该方法包括：提供待测人基因组DNA；提供扩增人NEFM基因rs12515位点附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引物具有错配碱基G；以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以获得含GTAAAY片段的扩增产物其中Y为人NEFM基因rs12515位点上的待定碱基C或T；提供限制性内切酶；利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切以获得相应的酶切产物；以及根据所得酶切产物来确定人NEFM基因rs12515位点上的待定碱基Y是C还是T。限制性内切酶为仅能够切开GTAAAC片段与GTAAAT片段之一的限制性内切酶。本发明的测定手段不但快速可靠，而且测定成本大大降低。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105316406
【申请号】CN201510615160
【发明人】王思华, 余善法, 李奎荣, 吴辉, 周世义
【申请人】河南省职业病防治研究院
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年9月24日