化苯甲醒耐受酵母菌株，即为生物催化剂；其中，所述复合载 体为含聚乙締醇和海藻酸钢的固定化缓冲液，所述固定化缓冲液为含20mmol/LΜ拆〇4和 Immol/L硫胺素焦憐酸0W)的0. 5ΜΚΗ2ΡΟ4/Κ2ΗΡΟ4缓冲液，所述聚乙締醇的质量百分比浓 度为5-15% ;所述海藻酸钢的质量百分比浓度为1. 5-2. 5% ;
[0030] 具体操作为：将聚乙締醇和海藻酸钢和Ig苯甲醒耐受酵母菌株加入到4ml的含 20mmol/LΜ拆〇4和Immol/L硫胺素焦憐酸灯PP)的0. 5MKH2PO4/K2HPO4缓冲液中，混匀后 用20ml注射器吸取混合液并滴入4°C的含0.2%戊二醒的4%化C12饱和棚酸溶液中制粒 固化2地，洗涂2~3次，转入转化培养基中；
[0031] (2)微生物转化
[0032] 用50ml摇瓶盛装为摇瓶容量的10 %的含生物催化剂的转化培养基，30°C、200r/ min活化比后，加入等体积辛醇，再一次性添加底物1200mmol/L苯甲醒、7%葡萄糖、600mM 丙酬酸钢，培养化实现转化的连续反应。 W33] 所述转化培养基的组成为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉lOg/L，MgClzO. 5g/L， (NH4)2S〇4l〇g/l，MnClzO. 2g/l，CaClzO. 2g/l，KH2PO4O.6g/l，pH用醋酸钢-冰醋酸调至6. 5。
[0034] 生物催化剂转化合成L-PAC的原理，如图3所示，包括：在辛醇/水两相体系中固 定化苯甲醒耐受酵母菌株中存在的丙酬酸脱簇酶实现丙酬酸脱簇反应而产生活性乙醒，活 性乙醒和底物苯甲醒缩合而合成具有手性结构的产物L-PAC。
[0035] 从两相中分别取1ml反应液，12000r/min4°C离屯、10分钟，取样品上清200ul，用多 于样品5倍的乙醇溶解样品，对最终得到的反应液进行HPLC检测。
[0036] 分析条件是：仪器为Agilent1100高效液相色谱，分析柱为化dera0DS-2柱 巧μm，250mmX4.6mm);流动相为乙腊和水梯度洗脱，0-20min乙腊10%-50%，20-21min 乙腊50%，21-25111111乙腊50%-10%，流速为1.0血/111111。
[0037] 在283nm下检测产物kPAC和底物苯甲醒，kPAC和苯甲醒出峰时间分别14.6min 和19.6min，最终可W确认制备得到的L-PAC浓度，图谱见图4,结果如表1所示，复合载体 采用10%PVA与2%海藻酸钢最佳。
[0038] 表1复合载体对合成L-PAC的影响
[0039]
W40] 实施例3
[0041] 本实施例与实施例2基本相同，不同之处仅在于：步骤（3)中，反应体系中还添加 了1.2%添加剂β-环糊精。
[0042] 对最终得到的反应液进行HPLC检测，制备得到的kPAC浓度为34g/L。 柳43] 实施例4
[0044] 本实施例与实施例2基本相同，不同之处仅在于：步骤（3)中，反应体系中还添加 了 2. 5mol/L3-(N-吗嘟）丙横酸（MOP巧。
[0045] 对最终得到的反应液进行HPLC检测，制备得到的kPAC浓度为45g/L。
【主权项】
1. 酿酒酵母菌在生物合成L-苯基乙酰基甲醇中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：包括以下步骤： (1) 苯甲醛耐受酵母菌株的获得：将酵母菌株活化后接种于含不同浓度苯甲醛的固体 培养基中培养；将苯甲醛耐受菌株接种到高浓度种子培养基中培养；将生长到稳定期的细 胞分离后，再接种到相同的高浓度种子培养基中培养；获得的稳定期的菌株，即为苯甲醛耐 受酵母菌株； (2) 生物催化剂的构建：利用复合载体固定化苯甲醛耐受酵母菌株，即为生物催化剂； (3) 微生物转化：生物催化剂、底物在转化培养基和等体积辛醇的两相体系中发酵即 得L-苯基乙酰基甲醇。3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（1)中，所述酵母菌为酿酒酵母菌为 S.cerevisiae AY93161〇4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（2)中，所述复合载体为含聚乙烯醇和 海藻酸钠的固定化缓冲液；所述固定化缓冲液为含20mmol/LMgS<VfPlmmol/L硫胺素焦磷 酸的0. 5MKH2P04/K2HP0^冲液；复合载体中，所述聚乙烯醇的质量百分比浓度为5-15% ; 所述海藻酸钠的质量百分比浓度为1. 5-2. 5%。5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（2)中，复合载体固定化苯甲醛耐受酵 母菌株的步骤具体为：将聚乙烯醇和海藻酸钠和lg苯甲醛耐受酵母菌株加入到4ml的含 20mmol/LMgSO#lmmol/L硫胺素焦磷酸的 0. 5MKH2P04/K2HP0#1冲液中，混匀后用 20ml 注射器吸取混合液并滴入4°C的含0. 2 %戊二醛的4 %CaCl2饱和硼酸溶液中制粒固化24h， 洗涤2~3次。6. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（3)中，所述转化培养基的组成为： 葡萄糖 30g/L，酵母浸粉 10g/L，MgCl20. 5g/L，（NH4)2S0410g/L，MnCl20. 2g/L，CaCl20. 2g/L， KH2P040 . 6g/L，pH用醋酸钠-冰醋酸调至6. 5。7. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（3)中，反应体系中还可加入添加剂， 所述添加剂为β-环糊精或3-(N-吗啉）丙磺酸。
【专利摘要】本发明提供了酿酒酵母菌在生物合成L-苯基乙酰基甲醇中的应用，包括苯甲醛耐受酵母菌株的获得、生物催化剂的构建、微生物转化等步骤。该方法一方面通过筛选酵母菌株获得对苯甲醛的耐受性高、生长性状稳定的酵母菌株，另一方面采用复合载体固定化苯甲醛耐受酵母菌株改善菌体的代谢状况，稳定并延长酶的催化时间，改进反应条件，提高关键底物苯甲醛的浓度，简化菌体与转化液分离程序，从而提高L-PAC累积量(转化液中L-PAC浓度接近45g/L)。该方法大大提高了原料利用率，降低了生产成本，显著提高L-PAC的产量，可为生物法合成麻黄素的产业化奠定基础。
【IPC分类】C12R1/865, C12P7/26
【公开号】CN105331639
【申请号】CN201510929395
【发明人】许激扬, 卞筱泓, 张修芹, 朱兴宇, 孙天娇
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年12月11日