反应进行检测，通过 优化反应体系和反应程序，能够对±壤中含量极低的小麦矮腥黑粉菌进行绝对定量。
【附图说明】
[0039] 图1.采用本发明方法提取的±壤样品的总DNA。
[0040] 图2.采用FastDNATM SPIN Kit化r Soil所附带的提取步骤提取±壤样品的总 DNA。
[0041] 图3.微滴数字PCR法检测±壤样品TCK含量的微滴数分布图，
[0042] 其中，横坐标表示微滴数，纵坐标表示巧光强度，图中蓝色为阳性微滴数，黑色为 阴性微滴数。由图中蓝色簇面积可直观得到检测结果。
[004引图4.微滴数字PCR法检测±壤样品TCK含量的的阳性拷贝数，
[0044] 其中，横坐标表示样品名称，纵坐标表示可检测到的阳性拷贝数，阳性拷贝数的单 位为copies/μ L。由图得到可检测到的最低拷贝数为3. 2copies/μ L。
[0045] 图5.样品生成的阳性微滴数与总微滴数的柱状图，
[0046] 其中，横坐标表示样品名称，纵坐标表示微滴数，紫色为阳性微滴数，蓝色为总微 滴数。总微滴数生成在10000W上得出的结论可靠准确，阳性微滴数为0,上壤未检测到TCK 冬抱子。
[0047] 图6.微滴数字PCR法检测一般方法提取的±壤DNAW及阴性对照样品微滴数分 布图，
[0048] 其中A图，横坐标表示微滴数，纵坐标表示巧光强度，黑色为阴性微滴数，阳性微 滴数为0巧图深蓝色为阴性微滴数，浅蓝色为总微滴数。
【具体实施方式】
[0049] 下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，需要理解的是，W下实施例仅作为 解释和说明，而不W任何形式限制本发明的范围。
[0050] 下述实施例未特别说明的生物化学试剂，均为本领域常规试剂，可W通过本领域 常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可。
[0051] 含有TCK冬抱子的±壤来自中国农业科学院植物保护研究所，为实验室采 用TCK冬抱子接种小麦试验过程中产生的侵染±壤。TCK菌种为小麦矮腥黑粉菌 (Tilletiacontroversa肺hn)菌株：本发明所有的TCK菌株为现有文献L.GA0et al.DevelopmentofaSCA民Makerbyinter-simplesequencerepeatfordignoisis ofDwarfBuntofWheatandDetectionofTilletiacontroversaKlihn.Folia Microbiol. 55(3)，258 - 264(2010)所记载，参见其中材料与方法部分记载的在美国由 B.Goates教授分离到的分离株。另外也记载在L.GA0etal.AnISSR-basedApproachfor theMolecularDetectionandDiagnosisofDwarfBuntofWheat,CausedbyTilletia controversaKuhn.JF*h}ftopatholl59:155 - 158(2011)，为其中材料与方法部分记载的 DrBlairGoates所提供的TCK菌株。本实验室亦有保存，可自申请日起二十年内向公众发 放用于验证实验。
[0052] 实施例1.采用本发明方法检测±壤中的TCK冬抱子
[0053] ±壤样品的前处理：
[0054] 将采集的25份鲜±样过40目网筛，放入小号自封袋，并在每个自封袋上写明取样 地点、所种植的小麦品种、时期及取样时间，置于-20°C冰箱中过夜。提取DNA前，将经过冷 冻处理的±样从冰箱中取出，称取0.5g±样置于2mlLysing Matrix E化be中（内含研 磨珠），然后使用细胞震荡破碎仪，6. 5M/S震荡2分钟。
[0055] 1、采用化stDNA?SPINKit化rSoil试剂盒，按照下列优化过的步骤提取±壤样 品的总DNA:
[0056] (a)称取 500mg上壤加到LysingMatrixETube中；
[0057] (b)力日 978ulsodiumF*hos地ateBuffer到管中；
[0058] (c)加 12化 1MTBuffer;
[0059] (d)将加好样的LysingMatrixETube放到细胞震荡破碎仪中，6. 5M/S震荡2分 钟（或Mini-Beadbeater震荡 2 分钟）；
[0060] (e) 14000r/min离屯、10 分钟；
[0061] (f)将上清液转移到一个2ml管，加入250ulPPS，混合均匀；
[0062] (g) 1400化/min离屯、5分钟，将上清液转移到一个新的2ml管；
[0063] 化）加入1mlBindingMatrix(使用前充分混匀）；
[0064]ω满旋2分钟，让DNA充分结合基质，满旋后将管放到管架上静置3分钟；
[00财 U)去除500ul上清液，避免碰到沉淀；
[0066] (k)重悬试管让BindingMatrix重新混匀，取约600ul的混合液转移到Spin Filter中，14000;r/min离屯、1分钟，倒空流出液，再把剩下的上清液加入SpinFilter中， 140(K)r/min离屯、1分钟，倒出流出液；
[0067] (1)加500ul的沈WS-M(药品使用前加入无水乙醇）到SpinFilter中，利用水流 重悬里面的固体；
[006引 （m) HOOOr/min离屯、1分钟，倒出流出液；
[0069] (η) 14000r/min空离2分钟，W清空SpinFilter中剩余的沈WS-M液体；
[0070] (0)移动SpinFilter到新的化tch化be中，放置于室溫下风干5分钟；
[007。 （P)加入50ul的DES，用枪头轻轻揽动滤膜，将样品放到55度水浴锅中加热5分 钟；
[0072] (q)取出样品后，14000;r/min离屯、1分钟，弃掉SpinFilter,将化tchTube中的 DM放置于4度冰箱备用。
[0073] 琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA，结果如图1所示，提取的DNA质量较好。用紫外 分光光度计值enovix)测DNA的浓度，结果表明，采用改良后的方法提取的DNA的0D260nm/ 0D280皿的比值均在1.8至1. 9左右，浓度均在200~3(K)ng/μL，与琼脂糖电泳结果相符 么 η〇
[0074] 2、同样的±样，采用FastDNA?SPINKitforSoil所附带的提取步骤提取DNA。 [007引琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA，结果如图2所示，Marker条带出现，而提取的± 壤DNA没有检测到条带。用紫外分光光度计值enovix)^UDNA的浓度，结果表明，提取的DNA 的0D260nm/0D280nm的比值均在1.4-1.6左右。由此表明，按照化stDNA?SPINKitfor Soil试剂盒说明书中的提取方法不能提取出±壤总DNA。
[007引 3、W步骤1和步骤2获得的±壤样品总DNA为分别作为模板，采用下列引物对：
[0077]ISSR859-140A:5' -TGGTGGTCGGGAAAGATTAGA-3,，
[0078]ISSR859-511A: 5, -GGGACGAAGGCATCAAGAAG-3,，
[0079] 按照下列反应体系和反应程序进行常规PCR反应：
[0080] PCR反应体系 总体积巧山 2 X Taq PCR mix 12.5 ul F".P 1 lOuJVn lul
[0081] R.P nOuM) i ul DNA nOOng/ul) 1 ul 她磁0 9Jul
[0082] PCR反应程序
[0083] 步骤1 94Γ 5min 预变性 步骤2 94°C 20s 变性 步骤36〇r20s 退火 步骤4 72 ΓMs 延伸
[0084] 35个循环
[0085]步骤 5 72 °C 7min 延伸
[0086]PCR产物保存于4°C 结束
[0087] 采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果所有样品中都没有祀带扩增。本研究 采用试剂盒提取±壤总DNA，使用常规PCR检测不到小麦矮腥黑穗病菌，说明总DNA中菌量 含量极低，需要采用灵敏度更高的方法进行定量分析。
[0088]4、采用微滴数字PCR法检测TCK冬抱子
[0089] 微滴式数字PCR(QX200,BI0-RAD，USA)反应包括配置体系、生成微滴、扩增循环和 信号读取4个步骤。
[0090] (1)配置体系
[0091]W步骤1提取的DNA为模板，采用下列引物：
[0092]正向引物：5 '-ACGACCGACTTTCCGAGAGC-3'，
[0093