]反向引物：5 ' -GTGTGGGACGAAGGCATCAA-3 '，
[0094]探针引物：FAM5' -ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3'TAMAR，按照下列体系进行配置：
[0095]微滴数字PCR体系为20 μL包含10 μ L ddPCR Supermix for Probes (186-3026， BIO-RAD，USA)，10yL/mol正向引物和反向引物各1.8μ^探针0. 6μ^DM模板2. ΟμL^， (1地2〇3· 8 μ Lo
[009引 似生成微滴
[0097] 生成微滴需要使用专口的微滴生成卡（186-4007,BIO-RAD，USA)和微滴生成仪， 将40μLPCR体系和70μL微滴生成油（186-3005,BI0-RAD，USA)加入微滴生成卡，覆盖专 用胶垫后置入微滴生成仪，生成微滴。
[0098] 制备微滴的步骤如下：
[0099] (a)将20μ1反应液加入到微滴发生卡中间一排的8个孔内，不足8个样品时用 20μ1 1X溶液D补足，建议使用8通道20μ1排枪和20μ1枪头（不能用200ul枪头）， 加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升 枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置W免引入气泡。
[0100] 化）在微滴发生卡最底下一排8个孔中各加入70μ1微滴生成油，同样不能有空着 的孔。
[0101] (C)盖上胶垫，注意两边的小孔都要钩牢。
[0102] (d)将W上卡托（186-3051，BI〇-RAD，USA)轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始 生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2分钟之内完成
[010引 （e)微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，建议使用8通道排枪和200μ1枪头 小屯、缓慢吸取，调整吸取体积为40μ1，将卡托放平，枪头W与孔壁呈30~45°角放入，轻 触孔底，约5秒吸取40ul，再同样缓慢地打入96孔板（0030128605,巧pendorf，Genmany) 相应位置孔内（约5秒），枪头贴近孔壁接近孔底，注意封上盖W防油挥发，每次弃去已使用 过的微滴发生卡和胶垫。
[0104] 讯封膜：
[0105] 封膜仪（181-4000,BI0-RAD，USA) 180 度热封，使用密封锥（181-4040,BI0-RAD， USA)封好之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4°C冰箱4小时之内进行PCR，可在 任意一台96孔PCR仪上完成，注意升降溫速度《2. 5°C/s。
[0106] (3)扩增循环
[0107] 微滴数字PCR扩增使用两部法，设置程序如下：
[010引
[0109] (4)信号读取
[0110] (a)扩增结束后，将96孔板放入plateholder中组装好，注意板斜角方位，组装好 之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中读取信号。
[0111] 化）使用软件如antaSoft分析实验数据，获得绝对定量结果。
[0112] W步骤1提取的DNA为模板，检测结果如图3~5所示。
[0113] 图3是微滴数字PCR法检测±壤样品TCK含量的微滴数分布图，其中，横坐标表示 微滴数，纵坐标表示巧光强度，图中蓝色为阳性微滴数，黑色为阴性微滴数。由图中蓝色簇 面积可直观得到检测结果。
[0114] 图4是微滴数字PCR法检测±壤样品TCK含量的的阳性拷贝数，其中，横坐标表示 样品名称，纵坐标表示可检测到的阳性拷贝数，阳性拷贝数的单位为copies/μL。由图得到 可检测到的最低拷贝数为3. 2copies/μL。
[0115] 图5是样品生成的阳性微滴数与总微滴数的柱状图，其中，横坐标表示样品名称， 纵坐标表示微滴数，紫色为阳性微滴数，蓝色为总微滴数。总微滴数生成在10000W上得出 的结论可靠准确，阳性微滴数为0,±壤未检测到小麦矮腥冬抱子。
[0116] W步骤2提取的DNA为模板，检测结果如图6所示，其中A图，横坐标表示微滴数， 纵坐标表示巧光强度，黑色为阴性微滴数，阳性微滴数为0;B图深蓝色为阴性微滴数，浅蓝 色为总微滴数，总微滴数与阴性微滴数相同，说明没检测到阳性微滴。
[0117] W上结果说明，采用本发明的±壤DNA提取方法，结合微滴数字PCR方法，能够高 灵敏度地检测到±壤中的TCK冬抱子。
【主权项】
1. 微滴数字PCR检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法，其特征在于，包含如下步骤： (1) 提取待测土壤样品的总DNA; (2) 以待测土壤样品的总DNA为模板进行微滴数字PCR反应，得到PCR产物； (3) 将PCR产物放入微滴读取仪中读取信号，分析实验数据，获得土壤样品中小麦矮腥 黑粉菌的绝对含量， 其特征在于，土壤中小麦矮腥黑粉菌的总DNA提取方法如下： 将取回的土壤样品过网筛除去杂质；然后冷冻； 采用FastDNA?SPINKitforSoil试剂盒提取土壤样品的总DNA，步骤如下： (1) 称取 500mg土壤加到LysingMatrixETube中； (2) 加978ulsodiumPhosphateBuffer到管中； (3) 加122ulMTBuffer;采用细胞震荡破碎仪以6. 5M/S震荡2分钟对土壤样品进行 处理； (4) 14000r/min离心 10 分钟； (5) 将上清液转移到一个2ml管，加入250ulPPS，混合均匀； (6) 14000r/min离心5分钟，将上清液转移到一个新的2ml管； (7) 加入lml充分混勾的BindingMatrix; (8) 涡旋2分钟，让DNA充分结合基质，涡旋后将管放到管架上静置3分钟； (9) 去除500ul上清液，避免碰到沉淀； (10) 重悬试管让BindingMatrix重新混勾，取约600ul的混合液转移到SpinFilter中，14000r/min离心1分钟，倒空流出液，再把剩下的上清液加入SpinFilter中，14000r/ min离心1分钟，倒出流出液； (11) 加500ul的已加入无水乙醇的SEWS-M到SpinFilter中，利用水流重悬里面的固 体； (12) 14000r/min离心1分钟，倒出流出液； (13) 14000r/min空离2分钟，以清空SpinFilter中剩余的SEWS-M液体； (14) 移动SpinFilter到新的CatchTube中，放置于室温下风干5分钟； (15) 加入50ul的DES，用枪头轻轻搅动滤膜，将样品放到55度水浴锅中加热5分钟； (16) 取出样品后，14000r/min离心1分钟，弃掉SpinFilter，将CatchTube中的DNA 放置于4度冰箱备用。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微滴数字PCR反应的体系为：10μL ddPCRSupermixforProbes，10μL/mol正向引物和反向引物各 1.8μL，探针 0.6μL，DNA 模板 2· 0μL，ddH20 3· 8μL。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述正、反向引物及探针引物的核苷酸序 列为： 正向引物：5 ' -ACGACCGACTTTCCGAGAGC-3 '， 反向引物：5 ' -GTGTGGGACGAAGGCATCAA-3 '， 探针引物：FAM5' -ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3'TAMAR。4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述微滴数字PCR反应的程序为： 95°C预变性10分钟，1个循环；94°C变性15秒，58°C退火30秒，72°C延伸30秒，10个循环； 94°C变性15秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，30个循环。
【专利摘要】本发明涉及微滴数字PCR(ddPCR)检测土壤中TCK冬孢子的方法，步骤包括：(1)提取待测土壤样品的总DNA；(2)以待测土壤样品的总DNA为模板进行微滴数字PCR反应，得到PCR产物；(3)将PCR产物放入微滴读取仪中读取信号，分析实验数据，获得土壤样品中小麦矮腥黑粉菌的绝对含量。所述总DNA提取方法包括：将取回的土壤样品过网筛除去杂质，然后冷冻；采用FastDNATM？SPIN？Kit？for？Soil试剂盒提取土壤样品的总DNA。本发明方法能够从土壤中提取出质量较好的DNA，采用微滴数字PCR进行检测，实现了土壤中小麦矮腥黑粉菌的绝对定量，有利于及时采取防治措施，减少经济损失。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/06
【公开号】CN105331713
【申请号】CN201510819292
【发明人】高利, 蔚慧欣, 沈慧敏, 齐婷, 董二容, 陈万权, 刘太国, 刘博
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月23日