一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂，属于沼气添 加剂技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着新型温室大棚、精准施肥等先进农业生产设备和技术的推广普及，以及众多 蔬菜新品种的引进和改良，我国蔬菜种植业取得了蓬勃发展，品种繁多的各类蔬菜极大丰 富了城乡广大群众的菜篮子，也显著提高了种植户的经济收入。但值得注意的是，在蔬菜种 植过程中，不可避免的会产生不适合食用的茎杆、叶、根等植株部分，而在产品运销过程中， 也可能遇到部分蔬菜腐坏变质的问题。这些非食用植株部分和腐烂变质产品属于农业固体 废弃物的范畴，如果不加处理或处理不当，任由继续腐烂变质、孳生蚊蝇，不但会污染环境， 而且还可能引起人、畜传染病及农作物病虫害的发生，因此必须加以妥善的处理。
[0003] 对于农业固体废弃物的处理方式，目前主要有填埋、晒干焚烧、好氧堆肥、厌氧发 酵等手段。受制于土地资源的紧张和可能存在的泄漏进而污染地下水等问题，填埋的方式 不宜广泛推广；晒干焚烧虽然成本较低，但是如果燃烧温度不够，可能产生二恶英等剧毒有 害化合物，污染空气；好氧堆肥手段简单便捷，但是周期较长，散发的大量臭味气体会给周 边社区带来困扰；而厌氧发酵由于在密闭容器中进行，可以有效避免臭味气味散发的问题， 免除对周围空气环境的污染，而且可以产生清洁能源-沼气，和优良的绿色肥料-沼渣、沼 液，实现"变废为宝"，资源高效利用，应用前景广阔。但该方式也存在前期投入较大，技术门 槛高等问题，需要农村科技人员积极做好科研和服务工作。
[0004] 蔬菜废弃物具有含水、含糖量高，易腐败、成分差异大等特点，以其为原料进行 厌氧发酵时，由于底物极易被起始发酵微生物利用，发酵速度通常较快，导致次级代谢产 物-有机酸在短时间内的快速累积，如果这些有机酸类物质不能及时被下游产甲烷古菌等 微生物利用消化，则会使发酵体系过酸化，pH急剧下降，多数功能微生物的代谢受到抑制， 进而导致沼气发酵体系的崩溃，无法实现沼气的正常产生。针对这一问题，可以用人工投加 碱性物质调节PH、增加牛粪等耐消化底物以改变物料配比等手段加以应对，但是这些方案 也存在操作繁琐，受物料来源限制性大等问题，在很多情况下并不合适。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微 生物制剂。
[0006] 术语说明
[0007]LB培养基：主要成分为蛋白胨，酵母提取物和NaCl，三者以重量百分比计，分别为 1 %，0. 5 %，1 %。各成分溶于蒸馏水中，115°C灭菌30分钟即可。如果需要制成固体培养基， 则加入1~2%的琼脂粉。该培养基广泛用于细菌的培养。
[0008] YPD培养基：即酵母浸出物-蛋白胨-葡萄糖培养基，其中三种成分的含量以重量 百分比计，分别为1%，2%，2%。各成分溶于蒸馏水中，115°C灭菌30分钟即可。如果需要 制成固体培养基，则加入1~2%的琼脂粉。该培养基常用于酵母菌的培养。
[0009] 蔬菜废弃物：在蔬菜种植过程中产生的不适合使用的根、茎、叶等部分，及运输销 售过程中因腐烂变质丢弃的部分。
[0010] 厌氧沼气发酵：有机物在一定的水分、温度条件下，在厌氧环境中经多种沼气微生 物的共同作用，最终转化为以甲烷和二氧化碳为主的混合可燃气体-沼气的过程。
[0011] 微生物制剂：由一种或数种微生物菌株及其他辅助性原料按一定方法制成的活菌 制剂，按照功能不同广泛应用于食品生产、饲料加工、污水处理等不同领域。
[0012] 芽孢杆菌：一般指芽孢杆菌属的微生物，革兰氏阳性，能够生成对不利条件具有特 殊抵抗力的芽孢。广泛分布于土壤、植物表面、空气及动物肠道等环境中，对外界不良刺激 抵抗力强，为兼性厌氧菌，在无氧和有氧环境中均可良好生存。
[0013] 酵母菌：是一些单细胞真核微生物的统称，并不是一个分类学单元。大部分以裂殖 或芽殖进行无性繁殖，少部分可产生子囊孢子进行有性繁殖。酵母菌为兼性厌氧菌，在无氧 和有氧环境下均能生存。自然界中，酵母菌分布广泛，在水果、蔬菜、潮湿土壤环境中均有分 布。
[0014] 菌落形成单位（CFU，Colony-FormingUnits):指通过平板计数法统计得到的单位 面积内菌落总数，用来表示活菌总数。
[0015] 本发明所述技术方案如下：
[0016] -种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂，包括：
[0017]枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis)活菌数不低于 3.0X109CFU/g;
[0018] 錯样芽孢杆菌（Bacilluscereus)活菌数不低于3.OX109CFU/g;
[0019]巨大芽抱杆菌（Bacillusmegaterium)活菌数不低于 2·0X109CFU/g;
[0020] 地衣芽抱杆菌（Bacilluslicheniformis)活菌数不低于 2· 0X109CFU/g;
[0021] 毕赤酵母（Pichiapastoris)活菌数不低于 1· 0X109CFU/g;
[0022] 酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)活菌数不低于 1· 0X109CFU/g。
[0023] 根据本发明优选的，所述复合微生物制剂还包括吸附剂，吸附剂的质量百分含量 为40~60%，吸附剂由如下重量份的组分构成：
[0024] 海藻糖1~2份、硅藻土3~6份、琼脂粉4~8份。
[0025] 进一步优选的，吸附剂由如下重量份的组分构成：海藻糖1份、硅藻土4份、琼脂粉 5份。
[0026] 根据本发明优选的，所述的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)来源于美国典型 培养物保藏中心，菌种编号：ATCC21005,或来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌 种编号：CICC10020 ;
[0027] 錯样芽孢杆菌（Bacilluscereus)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号： ATCC4342,或来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC10042;
[0028] 巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编 号：ATCC14581，或来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC20611 ;
[0029] 地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis)来源于中国工业微生物菌种保藏管理 中心，菌种编号：CICC10092,或来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC14580;
[0030] 毕赤酵母（Pichiapastoris)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 28485,或来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC32806 ;
[0031] 酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中 心，菌种编号：CICC1215,或来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC2341。
[0032] 根据本发明优选的，所述枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)、錯样芽孢杆菌 (Bacilluscereus)、巨大芽抱杆菌（Bacillusmegaterium)、地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)、毕赤酵母（Pichiapastoris)、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)的 活菌数之比为（2~4) : (2~4) : (2~4) : (2~4) : (1~2) : (1~2);进一步优选的，活 囷数之比为3 :3 :2 :2 :1 :1。
[0033] -种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂的制备方法，包括如下步 骤：
[0034] (1)将枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis)、錯样芽抱杆菌（Bacilluscereus)、巨 大芽抱杆菌（Bacillusmegaterium)、地衣芽抱杆菌（Bacilluslicheniformis)分别经活 化培养、摇瓶培养、种子培养和发酵培养，制得活菌浓度均为1. 〇~3.OX109CFU/ml的枯草 芽孢杆菌发酵液、蜡样芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液；
[0035] (2)将毕赤酵母（Pichiapastoris)、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)分 别经活化培养、摇瓶培养、种子培养和发酵培养，制得活菌浓度均为3. 0~5.OX10scfu/ml 的毕赤酵母发酵液和酿酒酵母发酵液；
[0036] (3)将步骤（1)制得的枯草芽孢杆菌发酵液、蜡样芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌 发酵液、地衣芽孢杆菌发酵液与步骤（2)制得的毕赤酵母发酵液、酿酒酵母发酵液按体积 比（2~4) : (2~4) : (2~4) : (2~4) : (1~2) : (1~2)的比例混合，制得混合菌液；
[0037] (4)向步骤（3)制得的混合菌液中加入吸附剂，吸附剂的加入量为混合菌液质量 的2~4%，经低温固液分离、低温干燥，制得复合微生物制剂。
[0038] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中的活化培养，条件均为：37°C静止培养24小 时，活化培养基为LB固体培养基；
[0039] 摇瓶培养条件均为：37°C摇动培养24小时，转速180r/min，摇瓶培养基为LB液体 培养基；
[0040] 种子培养条件均为：37°C摇动培养24小时，转速180r/min，种子培养基为LB液体 培养基；
[0041] 发酵培养条件均为：37°C摇动培养24小时，转速180r/min，发酵培养基为添加2% 葡萄糖的LB液体培养基。
[0042] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中的活化培养，条件均为：30°C静止培养24小 时，活化培养基为YPD固体培养基；
[0043] 摇瓶培养条件均为：30°C摇动培养24小时，转速180r/min，摇瓶培养基为YH)液 体培养基；
[0044] 种子培养条件均为：30°C摇动培养24小时，转速180r/min，种子培养基为YH)液 体培养基；
[0045] 发酵培养条件均为：30°C摇动培养24小时，转速180r/min，发酵培养基为额外添 加2 %葡萄糖的Yro液体培养基。
[0046] 根据本发明优选的，所述步骤（4)中，吸附剂由海藻糖、硅藻土、琼脂粉按质量比 (1~2):(3~6):(4~8)混合后，灭菌制得。进一步优选的，海藻糖、硅藻土、琼脂粉的质 量比为1 :4 :5。加入吸附剂后，活菌收获率可达96. 5%。
[0047] 根据本发明优选的，所述步骤（4)中，低温固液分离为在-20°C、3000