子育种，通常包括以下步骤：
[0031] (1)采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情 况，筛选到与秦川牛生长性状相关的CNV标记；
[0032] (2)利用SPSS19.0软件将拷贝数变异类型与牛生长性状等进行关联分析；
[0033] (3)根据拷贝数变异类型进行生长性状优异的秦川牛选育。
[0034] 1、秦川牛样本采集
[0035] 本发明具体以中国地方秦川牛品种作为检测对象，208头秦川牛的血样样本采集 自陕西省秦川牛良种繁育中心。
[0036] 2、基因组DNA的分离、提取、纯化
[0037]参考文献Sambrocketal(2002)方法。
[0038] 3、目标序列及参考序列的扩增
[0039]以NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛SHH基因序列 (GenBankAccessionNo.AC_000161)为参考序列，利用Primer5.0设计实时荧光定量PCR 引物对检测SHH基因拷贝数变异，其引物对序列信息如表1所示。通过绘制扩增曲线（图 1)和溶解峰来确定引物是否适用于qPCR分析。根据绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一 起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰（图2)。
[0040] 内参序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，即BTF3基因中的一段166bp的序 列。
[0041] 表1实时荧光定量PCR的引物信息
[0042]
[0043] 其中，进行实时荧光定量PCR所用的扩增体系以20yL计为：50ng/yL模板 DNA(提取自血样样本的基因组DNA) 1μL，1Opmo1/L的上、下游引物各1μL，2XSYBRGreen qPCRMix10μL，去离子水7μL。
[0044] PCR扩增的反应程序为：（1)预变性：95°C30s;⑵扩增反应：95°C变性10s，60°C 退火308,39个循环；（3)绘制溶解曲线：951€58，-0.01°(：/8,65°(：11^11。
[0045] 4、拷贝数变异的推断
[0046] 每个样品分别用目标序列和参考序列的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。 根据2方法进灯拷贝数的分析。其中ΔΔCt = (C τ目的基因-CT内参基因）实验组-(CT目的基因-CT 组。实验组即为待检测有无CNVs的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的样本。 2 表示的是实验组目标序列的拷贝数相对与对照组的倍数。然后将基因的表达丰度进 行对数转化（以2为底2Λ 的对数）使之符合正态分布，进行方差齐性检验后，统计检验 各组间的差异。
[0047] 当目标序列为正常型序列时，根据Log22 AAet计算出归一化值0左右（Log2
[0048] 2 |±0.5|)。当目标序列为缺失型序列时，Log22 AAet计算出归一化值 Log22AAet〈-0.5。当目标序列为插入型序列时，Log22AAet计算出归一化值Log22AAet>0.5。
[0049] 5、秦川牛SHH基因CNV位点与生长性状的关联分析
[0050] 表2. 1 SHH基因CNV与秦川牛品种生长性状的关联分析
[0051]
[0052] 表2. 1 SHH基因CNV与秦川牛品种生长性状的关联分析
[0053]
[0054] 生产数据：体长、体高、体重、胸围、胸宽、胸深和十字部高。
[0055] 关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分 析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS19软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基 因型效应进行分析时采用了固定模型：
[0056] Yijk=μ+Ai+CNVj+eijk
[0057] 其中：Yljk为性状观察值，μ为总体均值，Ai为第i头个体的年龄，CNVj为第j个 拷贝数变异类型的固定效应，e1]k为随机误差。各组数据间的差异性采用LSD多重比较进行 检验，试验结果以Mean土SE形式表示。
[0058] 关联分析结果表明（见表2):秦川牛SHH基因CNV位点可显著影响24月龄的体 高、体长、体重、十字部高，和30月龄的体长、胸围、体重、胸宽和胸深。并且，在两个年龄阶 段中，优势拷贝数变异类型均为插入型，说明SHH基因该CNV位点可以作为一个提高秦川牛 生长性状的候选分子遗传标记。
[0059] 6、上述CNV标记在秦川牛选育中的应用
[0060] 获得的CNV可作为候选分子遗传标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响牛生长性 状的数量性状基因座，以对秦川牛进行分子标记辅助选择，从而加快秦川牛品种改良的选 育进程。
【主权项】
1. 一种与秦川牛生长相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以秦川 牛基因组DNA为模板，以引物对P1和引物对P2为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增秦 川牛SHH基因CNV区域和内参基因BTF3，根据定量结果鉴定秦川牛SHH基因的拷贝数变异。2. 如权利要求所述一种与秦川牛生长相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：所述 的CNV标记是指牛SHH基因候选区域Chr4:118264951-118267170的拷贝数变异。3. 如权利要求1所述一种与秦川牛生长相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：所 述的拷贝数变异是根据l〇g2 2AAet将定量结果分为三类：插入型，Log2 2AAet>0. 5 ;缺失 型，Log2 2ΛACt〈-0. 5 ;正常型，Log2 2ΛACt彡 | ±0. 5 |。4. 如权利要求1所述一种与秦川牛生长相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：所 述的引物对P1为： 上游引物FI:5 ' -CGCACGCAATGAGACTTTA-3 '， 下游引物R1 :5, -AATAGCCAGGAGAGGTGAA-3,; 所述的引物对P2为： 上游引物F2 :5 ' -AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3 '， 下游引物R2 :5' -TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3'。5. 如权利要求1所述一种与秦川牛生长相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：所 述的实时荧光定量PCR所用的扩增体系以20μL计为：50ng/μL模板DNA1μL，10pm〇l/L 的引物对？1或引物对？2所对应的上、下游引物各1以1^，2\3丫81?6代6119?0?1^1(^1^ 以及去离子水7μL。6. 如权利要求1所述一种与秦川牛生长相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：所 述的实时荧光定量PCR所用的反应程序为：（1)预变性95°C30s; (2)扩增反应：95°C变性 10s，60°C退火30s，39个循环。7. 如权利要求1-6中任意一项权利要求所述的方法在秦川牛分子育种中的应用。8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的CNV标记应用在早期分子标记辅助 选择生长性状优秀的秦川牛品种。9. 如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述SHH基因CNV区域不同拷贝数与秦川 牛的生长发育显著相关，其中插入型个体的生长性状显著高于缺失型个体。
【专利摘要】本发明公开了一种与秦川牛生长相关的CNV标记的检测方法与应用：所述的CNV标记是指牛SHH基因候选区域Chr？4:118264951-118267170的拷贝数变异，该检测方法是以秦川牛的基因组DNA为模板，以引物对P1和P2为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增秦川牛SHH基因CNV区域和内参基因BTF3，根据log22-ΔΔCt将结果分为插入型、缺失型和正常型，从而鉴定秦川牛SHH基因的拷贝数变异。本发明可在DNA水平上检测与秦川牛生产性状密切相关的CNV标记，可作为秦川牛生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105349674
【申请号】CN201510867756
【发明人】陈宏 , 刘梅, 李波, 徐瑶, 蓝贤勇, 黄永震, 白跃宇
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月30日