样品，如试剂处理、溶解、沉降或对某些组分的富集。
[0040] "对照"、"对照样品"、"标准对照"或"对照值"是指用作参比，通常是已知参比的样 品，其用于与测试样品比较。例如，可从怀疑患有疾病或携带多态性的患者采集测试样品， 与患有已知疾病的患者、多态性携带者，或已知正常（无疾病）个体的样品比较。对照还可 代表从一群类似个体（例如具有类似医疗背景、同样年龄、体重等的患者或健康个体）收集 的平均值。还可从同一个体，例如从较早获得的样品，疾病之前，或治疗之前获得对照值。 "内部对照"是与要测试的反应或试验同时，通常在同一试管、孔、表面或容器内进行的反应 或试验的对照。可用内部对照检测样品内的异常。例如，检测样品内核酸的PCR反应的内 部对照包括已知的PCR引物和模板，其能在不存在抑制剂或反应内一些其它的异常的情况 下扩增。
[0041] 本领域技术人员会认识到可设计对照来评价任意数量的参数。本领域技术人员会 理解何种对照在给定的情况中有价值，并且能够基于与对照值的比较来分析数据。对照物 对于确定数据的显著性也具有价值。例如，如果给定参数的值在对照物中是广泛变化的，则 不认为测试样品中的变化是显著的。
[0042] 术语"核酸"指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物，及其 互补物。"核酸"或"寡核苷酸"或"多核苷酸"或本文所用的语法等同形式指至少两个共价 连接在一起的核苷酸。寡核苷酸通常长约5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50或更多个核 苷酸，直至约100个核苷酸。核酸和多核苷酸是任何长度的聚合物，包括较长的长度，例如 长 200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10, 000 等。术语"核苷酸"一般指多核苷酸 的一个单位，即单体。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其修饰形式。
[0043] "核酸模板"指包含目标序列，例如要扩增或被检测的序列，的单链或双链核酸分 子。例如，可用与5'PCR引物和3'PCR引物杂交的序列确定核酸模板。核酸模板可比被检 测的部分长，例如当用代表核酸模板子序列的探针检测时。例如，通过扩增引物确定的给定 的核酸模板可包含作为下游分析（例如检测、定量、测序等）焦点的遗传变体.
[0044] 如上所述，"遗传变体"指突变，单核苷酸多态性（SNP)，缺失变体，错义变体，插入 变体，反转，或拷贝数变体（CNV)。遗传变体可用作生物标记，并导致增加或减少的表达水 平，或差异修饰。
[0045] 本公开包括与已知标记或序列具有基本相似的序列相同性的多核苷酸和多肽。如 本文所用，当在两条多核苷酸或多肽的氨基酸序列之间具有至少约70%序列相同性，至少 约80%序列相同性，至少约90%序列相同性，至少约95%序列相同性，至少约99%序列相 同性，或100%序列相同性，或当多核苷酸（例如编码多肽的多核苷酸）能彼此在严格杂交 条件或实施者定义的条件下形成稳定的双链体时，这两条多核苷酸或多肽具有"大体序列 相同性"。本领域技术人员应理解，可在比全长基因序列短的序列中或在限定基因序列外检 测遗传变体，例如可采用PCR扩增包含遗传变体位点，或采用与包括遗传变体位点的序列 互补的探针。在有关序列相同性的方面或实施方式中，如本文公开，序列相同性可以与序列 一部分（例如长 15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、500、1000 或更多核酸 碱基或氨基酸）相关。
[0046] 术语"探针"或"引物"指一个或多个核酸片段，可检测其与样品的特异性杂交。 探针或引物可以是任何长度，视要使用的具体技术而定。例如，PCR引物通常长10-40个核 苷酸，而核酸探针通常更长，例如25-100个或100个以上核苷酸，例如长100-500个核苷 酸。可如下文所述不标记或标记探针或引物，使得其与靶序列的结合可被检测（例如用荧 光团）。可根据染色体的一个或多个特定（预选）的区域（例如一个或多个克隆，分离的 完整染色体或染色体片段，或聚合物链式反应（PCR)扩增产物的一个集合）设计探针或引 物。固定在目标元件上的核酸长度和复杂性对本发明不关键。本领域技术人员能调节这些 因素，来提供对给定的杂交和检测过程的最佳杂交和信号产生，并提供在不同基因或基因 组位置之间所需的分辨率。
[0047] 还可将探针和引物固定在固体表面（例如硝基纤维素、玻璃、石英、融合的二氧化 硅载玻片），以阵列形式。产生高密度阵列的技术也可用于此目的（见例如Fodor(1991) Science 767-773 ；Johnston (1998)Curr. Biol. 8:R171-R174 ；Schummer(1997) Biotechniques 23:1087-1092;Kern(1997)Biotechniques 23:120-124;美国专利号 5, 143,854).本领域技术人员应认识到可从目标序列一定程度改变特定探针和引物的确切 序列，以产生"大体相同"或"大体互补于"靶序列的探针，但仍然保留其与其衍生来源的同 一目标特异性结合（例如特异性杂交）的能力。
[0048] 如果探针或引物能够大体与核酸序列或与覆盖或接近遗传变体的区域互补，则其 对该核酸序列或遗传变体具有"特异性"或对其"能检测"。例如，为了检测SNP，引物可以 设计成在SNP的任一侧，用引物延伸测定在SNP位点上的核苷酸相同性。在一些实施方式 中，在探针仅与遗传变体杂交或仅与优势序列杂交的条件下使用探针。
[0049] 另外，对于核酸来说，术语"能够与……杂交"表示多核苷酸序列与互补序列形成 华生克里克键。本领域技术人员理解互补百分数根据多核苷酸长度、互补区长度（例如长 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100 或更多碱基）和条件的严格程度，无需 100%来发生杂交。例如，多核苷酸（例如引物或探针）可以随着互补区的延伸与具有60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%互补性的多核苷酸结合。对于检测遗传变体的情况，容忍的互补百分数或错配数目可 随检测所用技术变化（见下文）。
[0050] "杂交试验"是依靠互补核酸链之间的华生-克里克键合的试验。杂交可涉及引物 (例如在扩增或测序反应中）或探针（例如分子信标、或相互作用FRET探针）。在一些实 施方式中，引物和/或探针被标记。在一些实施方式中，杂交试验包括使用插入型染料。 [0051 ] 对于核酸的情形，术语"扩增产物"指扩增反应（例如PCR及其派生方法，逆转录， 链置换反应（SDR)，连接酶链式反应（LCR)，转录介导的扩增（TM)或QP复制）得到的核 酸（例如多核苷酸）。可用热稳定聚合酶，例如Taq避免在涉及循环或极端温度的扩增过程 (例如PCR及其派生方法）中重复加入聚合酶。
[0052] 除非另外说明，广义使用术语"试剂"以包括试验组分，例如酶、抗体、探针、结合试 剂（例如受体或靶）、样品、洗涤液、缓冲液、检测剂等。
[0053] 术语"标记物"、"可检测部分"、"可检测试剂"和类似术语指可通过光谱、光化学、 生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，有用的标记物包括荧光染 料、发光试剂、放射性同位素（例如32p、 3h)、电子密集试剂、酶、生物素、地高辛、或半抗原， 以及能够通过例如亲和力检测的蛋白质或其它实体。可以采用本领域已知的用于将标签偶 联到核酸或其它生物分子的任何方法，例如，使用如下文献中所述的方法：Hermanson，《生 物偶联技术》（Bioconjugate Techniques) 1996,圣迭戈的学术出版社有限公司（Academic Press，Inc.)。术语"标签"和与术语"标记物"作为同义词使用，但是一般指基于亲和性的 部分，例如，用于纯化的"His标签"或与生物素相互作用的"链霉亲和素标签"。
[0054] "带标记的"分子（例如，核酸、蛋白质或抗体）是共价（通过接头或化学键）或非 共价（通过离子、范德华力、静电或氢键）地结合标记物的分子，从而可通过检测与该分子 结合的标记物来检测是否存在该分子。来自标记物的信号可表示带标记分子的量。
[0055] 福斯特(I^rster)共振能量转移（缩写为FRET)，也称作荧光共振能量转移是一种 描述两个生色团之间能量转移的机制。供体生色团（FRET供体）最初为电子激发态，可通 过非辐射性偶极-偶极偶联将能量转移给受体生色团（FRET受体），该受体生色团通常距离 不超过10nm。当FRET供体和受体接近时，转移到FRET受体的能量作为光（能量）发射被 检测。因此，"FRET信号"是受体光发射产生的信号。相隔距离为R的供体和受体染料之间 福斯特共振能量转移的效率表示成E = I/ [1+ (R/R。)6]，其中R。是E = 1/2时供体-受体对 的福斯特半径。Rc对于常用的染料对（例如Cy3-Cy5)大约为50-60A。FRET信号随距离的 六次方变化。如果供体-受体对位于Rc左右，可以最大信噪比在IA到50A范围内测定距 离的微小改变。用目前技术，能对许多单一的FRET对实现Ims或更快的平行显像。
[0056] " FRET对"指能FRET检测的FRET供体和FRET受体对。
[0057] 本文中除非另外说明，以相同含义使用术语"荧光团"、"染料"、"荧光分子"、"荧光 染料"、"FRET染料"等。 C.扩增反应
[0058] 本文公开的试验和方法可包括使用一定范围的核酸扩增技术，例如PCR及其派 生方法（例如TaqMan、实时PCR、定量PCR)，逆转录，链置换反应（SDR)，连接酶链式反应 (LCR)，转录介导的扩增（TM)或QP复制。可用热稳定聚合酶，例如Taq避免在涉及循环或 极端温度的扩增过程（例如PCR及其派生方法）中重复加入聚合酶。这些方法是本领域已 知的，例如衣原体检测的PCR、LCR、TM和SDR的并列比较，描述于Gaydos等（2004) J. Cl in. Microbiol. 42:3041.
[0059] 聚合酶链式反应（PCR)是最常用的技术。PCR能产生大量特异性DNA片段，其长度 和序列都由核酸模板和5'及3'引物确定。主要步骤包括双链目标核酸的热变性，引物对 其互补序列退火，退火的引物通过DNA聚合酶的