淋巴细胞。Α:双特异性抗体 (10ng/mL) ;B :双特异性抗体（1000ng/mL) ;C :PBS ;D :0KT3(1000ng/mL)。
[0041 ] 图9.本发明双特异性抗体能够以直接给药方式介导T淋巴细胞杀伤SU-DHL-6细 胞。
[0042] 图10.本发明双特异性抗体重塑后的T淋巴细胞能够以细胞治疗方式杀伤Raji 细胞。
[0043] 图11.本发明双特异性抗体重塑后的LAK细胞能够以细胞治疗方式杀伤RS4 ;11 细胞。
[0044] 图12.本发明双特异性抗体重塑的靶向性LAK可靶向到荷瘤小鼠的肿瘤部位。A : PBS ;B :LAK ;C :靶向性 LAK。
[0045] 图13.本发明双特异性抗体能够以靶向性LAK细胞疗法抑制小鼠体内B细胞恶性 肿瘤的生长。
【具体实施方式】
[0046] 本发明设计并构建了一种含有⑶3scFv和⑶19scFv的双特异性抗体，使其具有足 够的结合活性和生物活性。更重要的是，此单链型双特异性抗体不带有标签蛋白，具有全人 源序列，可以避免临床治疗中可能的抗-抗体现象，提高药物的利用率。本发明也提供了不 依赖于标签的抗体检测方法。此外，与T淋巴细胞的稳定结合使得该双特异性抗体可以在 体外重塑T淋巴细胞，用于细胞疗法，拓展了双特异性抗体的应用。
[0047] 人体内的天然抗体是由重链和轻链组成，其中重链可变区和轻链可变区结构对于 抗原的结合特别重要。本发明的研究表明，由重链可变区和轻链可变区组成的融合蛋白 (即单链抗体）仍然具有良好的抗原结合活性。此单链抗体分子量仅约25kD，体积仅为天 然抗体的1/6,因此具有较好的组织渗透能力。天然抗体可变区是由重链可变区和轻链可变 区两条肽链组成的异二聚体，而scFv是由重链可变区和轻链可变区组成的融合单链，可能 会形成空间位阻，难以形成有效的抗原结合构象。因此，需要在重链可变区和轻链可变区之 间引入一条柔性连接肽，从而保证单链抗体能够形成正确的空间构象，具备有效的抗原结 合活性。此外，为保证双特异性抗体的两个不同的scFv具有各自的抗原结合活性，还需在 两个scFv之间引入一条柔性连接肽，以此避免两个scFv之间可能形成的空间位阻。
[0048] 本发明的双特异性抗体的设计也可以用于CD3scFv与其他抗肿瘤抗体的scFv融 合，所形成的双特异性抗体一方面可以发挥靶向肿瘤细胞的作用，另一方面可以激活T淋 巴细胞，从而发挥T淋巴细胞的肿瘤靶向杀伤作用。
[0049] 本发明描述的双特异性抗体可通过常规的基因重组技术所构建，具体实验步骤如 《分子克隆》第三版（Joseph Sambrook，科学出版社）及类似的实验手册所记载。所用的⑶3 单链抗体、⑶19单链抗体以及重组的⑶3-⑶19双特异性抗体可分别是：
[0050] 1.⑶3人源抗体的可变区，表示为⑶3scFv，编码核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示， 氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。
[0051] 2. CD19人源抗体的可变区，表示为CD19scFv，编码核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所 不，氣基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所不。
[0052] 3.重组的CD3-CD19双特异性抗体，表示为CD3scFv-CD19scFv，编码核苷酸序列如 SEQ ID NO. 5所示，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 6所示。
[0053] 上述双特异性抗体的DNA可以通过常规的基因重组技术获得。所需编码⑶3scFv 和⑶19scFv的DNA序列分别来源于人类抗体胚系基因。将编码上述scFv的DNA序列用 PCR获得后分别克隆到载体中，所用载体可以是分子生物学常用的质粒、病毒、DNA或RNA片 段。在编码上述双特异性抗体的DNA序列前端加上蛋白分泌信号肽序列，以保证双特异性 抗体能够从细胞中分泌。载体序列中包括用于基因表达的启动子、蛋白质翻译起始和终止 信号、以及多聚腺苷酸（PolyA)序列。载体中含有抗生素抗性基因，以利于载体在宿主细胞 如细菌和真核细胞中的复制和表达。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因，用于稳定转 染宿主细胞株的选择。
[0054] 本发明双特异性抗体发挥作用的区段为两个独立的scFv，因此在保证scFv完整 的情况下，scFv两端的氨基酸序列和长度可以有一定的变化而不减弱其生物活性，它们都 属于本发明的范畴。
[0055] 本发明双特异性抗体中scFv的重链可变区（VH)和轻链可变区（VL)的排列方式 以及两个scFv的排列方式可以互换，它们都属于本发明的范畴。
[0056] 本发明双特异性抗体的氨基酸序列可以通过取代和/或缺失和/或添加一个或几 个氨基酸等方法改造，从而获得与本发明双特异性抗体的功能相似的抗体，它们都属于本 发明的范畴。
[0057] 编码本发明双特异性抗体的核苷酸序列可以为简并序列，或者在限定的核苷酸序 列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，其所编码的抗体与 本发明双特异性抗体功能相同或相似。
[0058] 本发明双特异性抗体内部连接肽的目的在于提供更好的柔韧性，以避免CD3scFv 和CD19scFv内部和之间形成结构上的空间位阻，因此连接肽氨基酸序列和长度均可以有 一定的变化，它们都属于本发明的范畴。
[0059] 本发明双特异性抗体可以与其他蛋白进一步融合，以达到其他额外的作用，而不 影响其靶向性，它们都属于本发明的范畴。
[0060] 在完成含编码上述双特异性抗体的DNA序列的质粒构建以后，可以用该重组载体 转染或转化宿主细胞，表达相应的蛋白质。能够用于表达这些双特异性抗体的表达系统有 多种，可以是真核细胞，也可以是原核细胞，它们包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母、细菌 等。由于原核细胞表达双特异性抗体容易形成包涵体，因此哺乳动物细胞是表达该蛋白的 优选系统。可用于大规模表达双特异性抗体的哺乳动物细胞有多种，例如CHO细胞、293细 胞、NSO细胞、COS细胞等，它们都包括在本发明所能使用的细胞之列。含有编码上述双特异 性抗体基因的重组质粒可经转染进入宿主细胞。转染细胞的方法有多种，其中包括电穿孔 法、脂质体转染法和磷酸钙转染法等。
[0061] -种较佳的蛋白表达方法是利用稳定转染的宿主细胞表达。例如，用含有新霉素 (Neomycin)抗性基因的重组载体稳定转染无新霉素抗性的宿主细胞后，可在细胞培养液中 增加新霉素的浓度以筛选出高表达的稳定细胞株；又例如用含有二氢叶酸还原酶（DHFR) 基因的重组载体稳定转染缺乏DHFR的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加氨甲喋呤（MTX) 的浓度以筛选出高表达的稳定细胞株。
[0062] 哺乳动物细胞以外的其他表达系统，例如昆虫细胞、酵母、细菌等也可以用于表达 本发明的双特异性抗体，它们也被包含本发明所能使用的宿主细胞之列。这些表达系统的 蛋白质产量比哺乳动物细胞的较高，但是容易形成包涵体，因此需要进一步蛋白复性。
[0063] 本发明双特异性抗体属于单链抗体，不带有标签蛋白，无法采用传统的抗标签抗 体来实现检测。本发明为无标签单链抗体提供了相应的免疫印迹、ELISA、流式细胞术、免疫 荧光检测方法。辣根过氧化物酶（HRP)标记的Potein L (HRP-Protein L)适用于免疫印迹 和ELISA检测。Protein L和异硫氰酸荧光素（FITC)标记的抗Protein L抗体（FITC-Anti Protein L)适用于流式细胞术和免疫荧光检测。本发明提供的上述检测方法和思想可拓展 到其他类似的抗体检测。
[0064] 从重组体培养液中获得相应的双特异性抗体后，可以用流式细胞术来检测其对靶 细胞的结合活性，实验表明，本发明的双特异性抗体能够结合CD3阳性的细胞，也能够结合 CD19阳性的细胞，但不结合CD3阴性和CD19阴性的细胞，因此本发明所构建的双特异性抗 体可以有效靶向T淋巴细胞和B细胞恶性肿瘤细胞。ELISA分析显示，本发明的双特异性抗 体可以稳定持久地与靶细胞结合，显示出较好的时间效应，这是本发明双特异性抗体用于 靶向性细胞疗法的理论基础。本发明的双特异性抗体可以在体外使T淋巴细胞重塑为靶向 性T淋巴细胞，减少了细胞治疗所需的效应细胞数量，提高了细胞治疗的疗效，从而拓展了 双特异性抗体的应用和细胞治疗的理念。
[0065] 应用纯化方法获得高纯度的双特异性抗体后，可以检测其对T淋巴细胞的激活作 用，还可以用LDH释放法等方法检测其对B细胞恶性肿瘤细胞的杀伤作用。一方面，本发明 的双特异性抗体可以直接给药方式介导T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效应；另一方面本发 明的双特异性抗体还可以重塑T淋巴细胞，以靶向性细胞治疗的方式发挥对肿瘤细胞的杀 伤作用。
[0066] 本发明的双特异性抗体还可以用病毒载体来运载和表达，这些病毒载体包括但 不限于腺病毒载体